董晓毅
- 作品数：14 被引量：18H指数：3
- 供职机构：第二军医大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划上海市现代生物与新药产业发展基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 新型聚酮合酶基因簇的分离与部分鉴定被引量：5
- 2008年
- 目的从海洋沉积物中分离新型聚酮合酶(PKS)基因簇,并解析其基因结构,为研究PKS的组合生物合成提供新组件。方法采集中国东海沉积物样本,并提取宏基因组DNA,以其为模板,通过简并PCR扩增新型PKS片段,用地高辛标记正确的扩增片段作为探针,然后从本研究中构建的海洋沉积物样本Fosmid宏基因组文库中筛选完整基因簇,测序、结构分析。结果(1)所分离得到的海洋沉积物宏基因组DNA可直接作为PCR模板,简并PCR扩增得到26个新型KS编码片段,并成功提交GenBank;(2)所得DNA构建成滴度约5×108cfu/ml的Fosmid文库,插入片段平均长度约为40kb;(3)将其中的一个KS片段(GenBank登录号DQ942531)用地高辛标记并筛选部分文库,得到4个克隆,测序得到7981bp的序列(GenBank登录号EF568935),结构分析发现含典型的I型PKS组件,如酮缩酶(KS)、酰基转移酶(AT)、酰基载体蛋白(ACP)等。结论简并引物扩增、宏基因组文库筛选、测序、结构分析,在本研究中被证明是有效的分离新PKS基因簇的途径;通过系统进化树分析得出26条新KS片段属于Ⅰ型KS片断和杂合PKS/NRPS基因簇,主要来自放线菌门、δ变形菌门、蓝藻门和β变形菌门的微生物。
- 焦豫良王梁华董晓毅宗英高云任娜郭爱芸张兴群焦炳华
- 关键词：海洋沉积物聚酮合酶基因簇组合生物合成
- 新型酰基转移酶AT-EF080951的重组表达及底物结合分析
- 2008年
- 目的研究新型聚酮合酶(PKS)基因簇EF568935(GenBank登录号)中酰基转移酶(AT)EF080951(GenBank登录号)底物特异性,为PKS的功能研究及组合生物合成研究提供新组件。方法从酰基转移酶AT-EF080951结构域两端的连接肽区设计引物,通过PCR克隆其结构域基因at-EF080951;连接入原核表达载体pMAL-c2X,与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合表达;直链淀粉树脂柱亲和层析纯化MBP-AT-EF080951;融合蛋白用Xa因子切除MBP,得到AT-EF080951单体;以MBP、小牛血清白蛋白(BSA)为对照蛋白,用紫外分光光度法测定MBP-AT-EF080951与AT-EF080951对底物的结合能力,计算结合常数(Ka,μmol/L),分析其结合底物的特异性。结果(1)MBP-AT-EF080951与底物的结合常数为:甲基丙二酰辅酶A,0.0049±0.001;丙二酰辅酶A,0.0049±0.003;乙酰辅酶A,0.107±0.002;辅酶A,0.005±0.003。(2)AT-EF080951与底物的结合常数为:甲基丙二酰辅酶A,0.005±0.002;丙二酰辅酶A,0.0041±0.002;乙酰辅酶A,0.120±0.001;辅酶A,0.0042±0.003。结论MBP-AT-EF080951和AT-EF080951都特异性结合乙酰辅酶A,AT-EF080951可能是乙酰转移酶。
- 焦豫良王梁华董晓毅宗英高云任娜郭爱芸张兴群焦炳华
- 关键词：聚酮合酶酰基转移酶乙酰基转移酶组合生物合成
- 融合蛋白Kininogen D5_(60-148)-TRAIL_(114-281)的表达及其抑制血管新生和诱导细胞凋亡的作用被引量：2
- 2009年
- 目的:采用原核表达系统表达人Kininogen D560-148-TRAIL114-281融合蛋白,并对其生物学活性进行研究。方法:PCR技术扩增Kininogen D560-148和TRAIL114-281的编码序列,分别构建原核表达载体pMAL-Kininogen D560-148(pMAL-KD5)、pMAL-TRAIL114-281(pMAL-TRAIL)和pMAL-Kininogen D560-148-TRAIL114-281(pMAL-KT),重组质粒分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达融合蛋白MBP-KD5、MBP-TRAIL和MBP-KT,并经亲和层析纯化。MTT法检测细胞的增殖,管状形成实验检测内皮细胞血管形成,流式细胞仪和电镜检测细胞凋亡。结果:成功构建原核表达载体pMAL-KD5、pMAL-TRAIL和pMAL-KT,并获得纯化的融合蛋白MBP-KD5、MBP-TRAIL和MBP-KT。融合蛋白MBP-KT与MBP-KD5、MBP-TRAIL相比可显著抑制内皮细胞ECV304和胰腺癌细胞SW1990的增殖、明显抑制ECV304细胞体外管腔的形成,同时,MBP-KT剂量依赖性地诱导SW1990细胞凋亡。结论:融合蛋白Kininogen D560-148-TRAIL114-281既能诱导肿瘤细胞凋亡又能抑制血管生成,为进一步开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础。
- 宗英王梁华孙铭娟董晓毅王燕陆国才焦炳华
- 关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体血管生成抑制因子
- 东海洋山港沿岸土壤、海水样本中Ⅰ型PKS基因的初步筛选鉴定与功能分析被引量：4
- 2008年
- 为考察土壤和海水中Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因的多样性和差异,本研究自行设计了一套针对PKS基因中酮缩合酶(ketosynthase,KS)片段的简并引物,使用PCR方法直接克隆东海洋山港沿岸土壤和海水DNA样本中的KS片段,去除重复序列后,共获得了23条不同的KS片段(长度为630bp^690bp),提交GenBank皆获登录号,其中19条来自土壤(DQ640993、DQ640997、DQ641926、DQ641927、DQ673137~DQ673151),4条来自海水(DQ673151,EF554859~EF554861),由核苷酸序列推断出的氨基酸序列保守,与GenBank中已知KS基因片段的相似度在45%到85%之间,种系发生分析表明,其中14条KS片段(来源于海水的KS片段皆在其中)应来源于典型的KS群,而剩余9条则来源于杂合的PKS/NRPS(Non-ribosomal peptide synthetase,非核糖体多肽合成酶)群。另外,几条KS基因特征明显,可用于进一步的研究。
- 董晓毅王梁华孙铭娟宗英焦豫良焦炳华
- 关键词：聚酮合酶
- 产Macrolactins的海洋细菌X-2中Ⅰ型PKS基因簇的筛选鉴定与功能分析被引量：3
- 2008年
- Macrolactins是近年来从Actinomadura sp.和Bacillus sp.等海洋来源的微生物中分离的一群24元大环内酯类化合物,具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等生物学活性。本室从东海海泥中分离到一株海洋细菌X-2,可产生多种Macrolactins。本研究自行设计了一套针对Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因中酮缩合酶(ketosynthase,KS)片段的简并引物,使用PCR方法直接克隆到了X-2基因组中的一段长约645bp的Ⅰ型KS基因片段,提交GenBank获登录号EF486351,并以之为探针筛选X-2的fosmid基因组文库,得到了3个阳性克隆,测序获得的序列经同源性分析和功能预测,初步证实获得了该菌中负责生物合成Macrolactin的部分Ⅰ型PKS基因簇的功能序列。
- 董晓毅王梁华孙铭娟宗英焦豫良焦炳华
- 关键词：聚酮合酶枯草芽孢杆菌
- 人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定
- 2007年
- 目的克隆人血管生成素相关家族蛋白-1angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体。方法从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FDdomain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定。结果从人肝cDNA文库中扩增出1473bp的angioarrestin目的片段及其C-端560bpFDdomain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功。结论成功构建了angioarrestin和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础。
- 孙铭娟王梁华董晓毅宗英高云焦炳华
- 关键词：血管生成素1ANGIOARRESTIN转染
- 鲨鱼肠道微生物聚酮合酶基因资源初探
- 本文分离培养鲨鱼肠道中的微生物,获得可培养菌株15株.针对聚酮合酶的酮缩合酶保守区域设计引物,对15株菌的基因组进行PCR扩增,筛选出3个株菌具有新的KS片断.菌株用16S进行了鉴定,3株菌分别为假单胞菌、动性球菌和嗜冷...
- 焦豫良董晓毅王梁华孙铭娟宗英张兴群缪辉南焦炳华
- 关键词：肠道微生物聚酮合酶
- 文献传递
- Kininogen D5和TRAIL融合蛋白的克隆表达及生物学活性的研究被引量：3
- 2008年
- 用重组PCR技术得到Kininogen D5和TRAIL的融合编码序列,将该DNA片段克隆到原核表达载体pMAL-c2,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,得到MBP-KT和MBP-TK,经AmyloseResin亲和层析柱层析,得到初步纯化的融合蛋白。结果表明MBP-KT对胰腺癌细胞1990有明显的杀伤作用其作用的ED50为20 ng/ml,而MBP-TK对1990的抑制作用不明显;同时,MBP-KT和MBP-KD5对内皮细胞ECV304有明显的抑制作用,MBP/KT作用于ECV304的ED50为0.1μg/ml,MBP/KD5作用于ECV304的ED50为9.5μg/ml,但是MBP-TK和TRAIL几乎无作用,表明融合蛋白KT既具抗肿瘤作用又有抗新生血管的作用。本研究为进一步开发靶向性杀伤肿瘤药物奠定了基础。
- 宗英孙铭娟董晓毅高云王梁华焦炳华
- 关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体增殖抑制血管生成抑制因子
- Angioarrestin(hARP1)C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定被引量：1
- 2007年
- Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestinC端hFDcDNA和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经0.3mmol/LIPTG在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET-22b(+)表达系统获得的hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明:通过基因重组可获得angioarrestinC端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.
- 孙铭娟王梁华董晓毅宗英高云焦炳华
- 关键词：ANGIOARRESTINMBP大肠杆菌表达
- Kininogen D5和Trail融合蛋白的克隆表达和生物学活性的研究
- 本文用重组PCR技术得到Kininogen D5和TRAIL的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pMAL-c2中,重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导蛋白的表达,得到MBP-KT和MBP-TK,经Am...
- 宗英王梁华孙铭娟董晓毅焦炳华
- 关键词：增殖抑制融合蛋白克隆表达生物学活性
- 文献传递
