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治疗型VP22Δ-mE6Δ/mE7重组蛋白疫苗的表达与免疫学初步分析: 2009年; 制备16型人乳头瘤病毒mE6Δ/mE7蛋白与I型人单纯疱疹病毒VP22Δ蛋白的治疗型分子内佐剂融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性和抗肿瘤相关生物活性。通过克隆HSV-1 VP22Δ及HPV-16 mE6Δ/mE7基因,构建pET28a-VP22Δ-mE6Δ/mE7原核表达载体。重组质粒在Rosetta(DE3)宿主菌中进行诱导表达,表达蛋白经分离、复性后,通过镍离子亲和层析进行纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定,并免疫BalB/C及C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果显示,VP22Δ-mE6Δ/mE7蛋白以包涵体形式表达,分子量约为34kDa,表达量约占菌体总蛋白的45%。该蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG、特异性淋巴细胞增殖效果及对TC-1致瘤小鼠的肿瘤治疗效果均高于无佐剂单一重组蛋白疫苗。以上结果说明,所获得的重组融合蛋白具有较好的免疫原性和抗肿瘤活性,为治疗型HPV分子内佐剂疫苗的进一步研究奠定了基础。; 高丹丹彭正华杨旭毕研伟李智华姬秋彦李建芳李健峰徐维明; 关键词：HPV-16 重组蛋白疫苗

一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法: 本发明公开了一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法。系采用搭桥PCR构建含有B群脑膜炎球菌V1变异型全长FHBP蛋白和V2变异型的位于C结构域的一段抗原表位的融合基因片段，克隆入pET30a(+)载体后，IPTG...; 李健峰彭世泽姬秋彦李智华毕研伟高丹丹徐维明; 文献传递

一种纯化细菌荚膜多糖的方法: 本发明公开了一种纯化细菌荚膜多糖的方法，所述纯化方法利用非离子表面活性剂，通过相分离法纯化细菌荚膜多糖。细菌荚膜多糖疫苗的制备过程中需要尽可能多地去除杂质蛋白和内毒素，以减少疫苗的副反应。目前使用的苯酚抽提法、柱层析法以...; 寸韡肖红剑毕研伟李育中李智华丁晨高丹丹闫玲梅; 文献传递

A群脑膜炎球菌多糖-白喉毒素无毒变异体CRM197结合物的制备及其初步评价被引量：1: 2012年; 目的制备A群膜炎球菌多糖(Group A meningococcal polysaccharide,GAMP)-白喉毒素无毒变异体CRM197(Cross-reactive material 197)结合物,并分析其理化性质及免疫学特性。方法白喉棒状杆菌C7 M1菌株经发酵培养表达CRM197,表达产物经DEAE-4FF层析柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。用溴化氰(CNBr)活化GAMP,己二酰肼(ADH)为连接剂,在碳二亚胺(EDAC)催化下将GAMP与CRM197共价结合,制备GAMP-ADH-CRM197结合物,经Sepharose 4FF层析柱纯化后,进行各项生化检测,采用免疫双扩散检测结合物的抗原性,将结合物皮下注射ICR小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP的抗体滴度,分析其免疫原性。结果发酵培养20 h时,菌液上清中的CRM197蛋白表达量最高;CRM197以分泌形式表达,纯化后纯度达95%以上,可与白喉类毒素单抗发生特异性反应;GAMP-ADH-CRM197结合物各项生化指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求,与A群流脑诊断血清形成明显的沉淀线,结合物诱生的多糖特异性抗体滴度显著高于多糖组和混合物组。结论成功制备了GAMP-ADH-CRM197结合物,其具有良好的抗原性和免疫原性,为以CRM197为蛋白载体制备脑膜炎球菌结合疫苗奠定了基础。; 张营营蔡路奎姜博毕研伟高丹丹闫铃梅姬秋彦李智华徐维明; 关键词：A群脑膜炎球菌多糖白喉毒素变异体结合物载体蛋白

一种DNA病毒基因组的定点改造方法: 本发明提供了一种DNA病毒基因组的定点改造方法，解决了现有技术诱导DNA病毒基因组定点突变困难，插入外源片段操作复杂，重组率较低的问题。将携带有核酸酶系统的质粒转染细胞后，再感染病毒，待细胞出现病变后，收集病变细胞，经冻...; 寸韡李琦涵毕研伟孙乐高丹丹丁晨李智华肖红剑闫玲梅; 文献传递

一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法: 本发明公开了一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法。系采用搭桥PCR构建含有B群脑膜炎球菌V1变异型全长FHBP蛋白和V2变异型的位于C结构域的一段抗原表位的融合基因片段，克隆入pET30a(+)载体后，IPTG...; 李健峰彭世泽姬秋彦李智华毕研伟高丹丹徐维明

3种方法提取的B群脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡组分的免疫原性、毒性及杀菌活性被引量：3: 2011年; 目的采用3种方法提取B群脑膜炎奈瑟菌(Serogroup B Neisseria meningitidis,MenB)的外膜囊泡(Outer mem-brane vesicle,OMV),并分析其免疫原性、毒性和杀菌活性。方法分别采用去污剂+EDTA、EDTA、从培养上清液中离心提取3种方法获得MenB的OMV,即dOMV、nOMV和sOMV,SDS-PAGE分析OMV主要蛋白组分,Lowry法测定蛋白浓度,LAL试验测定内毒素含量。将3种OMV免疫小鼠,采用ELISA法测定小鼠血清中IgG抗体滴度,杀菌力试验测定3种OMV诱导针对MenB补体依赖的杀菌反应。结果 dOMV、nOMV和sOMV的主要蛋白成分基本一致,内毒素含量分别为5.0×103、7.5×104和4.0×106 EU/mg,产率分别为11.640、10.210和4.135μg/1010个细菌;dOMV、nOMV和sOMV组小鼠血清抗体滴度分为3.98×106、2.51×107和5.62×104,与阴性对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),杀菌抗体滴度分别为501.70、697.11和55.39。结论用3种不同的方法成功制备了3种MenB的OMV,并对其免疫原性、毒性和杀菌活性进行了比较,为研发B群脑膜炎OMV疫苗提供了理论依据。; 李晓晶高丹丹毕研伟姬秋彦闫玲梅戴宗祥李健峰李智华徐维明; 关键词：疫苗

人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化被引量：1: 2013年; 目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Top10,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性。结果经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36%;纯化的融合蛋白纯度可达95%,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应;与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P<0.05)。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV F1片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础。; 彭正华蔡路奎姬秋彦毕研伟罗娜肖红剑闫玲梅高丹丹李智华; 关键词：免疫原性

重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究被引量：3: 2011年; 采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V1变异型全长序列和V2变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段。并克隆入pET30a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%。表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白。将融合蛋白免疫小鼠,对其免疫原性进行了初步分析。结果显示,经2次腹腔免疫,血清IgG滴度达到15 849,同时杀菌力实验显示此融合蛋白能诱导针对B群脑膜炎球菌的补体依赖的杀菌反应。表明此融合蛋白具有较好的免疫原性,为B群脑膜炎球菌蛋白疫苗的研究提供了一定的理论基础。; 彭世泽肖红剑彭正华毕妍伟孙振璐戴宗祥高丹丹徐维明李智华李健峰; 关键词：脑膜炎奈瑟氏菌原核表达融合蛋白

重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定被引量：2: 2012年; 应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.; 姬秋彦毕研伟肖红剑闫玲梅高丹丹李智华; 关键词：分泌表达高密度发酵

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高丹丹

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