郁磊
- 作品数：8 被引量：13H指数：2
- 供职机构：南京农业大学动物医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省属高校自然科学基础研究项目转基因生物新品种培育专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- F18大肠杆菌黏附素受体结合域鉴定新方法被引量：4
- 2010年
- 运用DNA重组技术将F18ab和F18ac大肠杆菌黏附素fedF亚单位内的第60～109位氨基酸残基区段(fedF1)和fedF全基因克隆入V型分泌系统MisL的载客结构域上,经DNA测序确证其正确阅读框后,含重组菌质粒pnirBMisL-fedF或pnirBMisL-fedF1经厌氧诱导后,与断奶仔猪小肠上皮细胞进行体外黏附试验。结果表明:FUT1基因M307位点中GG型和AG型仔猪小肠上皮细胞均能黏附上述重组菌,而AA型个体小肠上皮细胞则不能黏附。上述重组菌均能与兔抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子高免血清发生玻板凝集反应。而FedF突变体FedF(M)的重组质粒菌则失去上述凝集和黏附特性。证明F18大肠杆菌黏附素fedF基因及其基因片段fedF1在大肠杆菌表面得到了功能性表达,F18ab和F18ac黏附素FedF直接介导F18大肠杆菌与易感仔猪小肠上皮细胞表面大分子受体黏附结合,fedF1为黏附素FedF的受体主要结合域,其His88、His99是FedF黏附素受体结合域的重要氨基酸残基。
- 葛兆宏陆广富朱军郁磊羊扬原志伟朱吕昌吴圣龙包文斌朱国强
- 关键词：F18大肠杆菌
- F18大肠杆菌黏附素在染色体-质粒平衡致死系统中的表达被引量：1
- 2010年
- 将含有启动子及核糖体结合位点RBS的E.coliK12菌株源asd基因克隆入表达质粒载体pnirBMisL-fedF中,构建重组表达质粒pMisL-fedF-asd,使该质粒中氨苄抗性基因失活的同时能表达fedF和asd基因。该重组质粒pMisL-fedF-asd转化E.coliDH5α宿主菌asd基因缺失株即DH5α△asd菌株后,表达F18E.coli黏附素的DH5α△asd重组菌能在不含DAP的LB平板生长,构成非抗性平衡致死系统。厌氧条件下诱导培养后,经玻板凝集反应、间接免疫荧光试验及易感仔猪小肠上皮细胞黏附试验表明,F18E.coli黏附素在DH5α△asd菌体表面得到了功能性展呈。经20次传代培养没有发现质粒丢失,F18E.coli黏附素在该系统中持续稳定表达。该染色体-质粒平衡致死系统的成功构建为研究F18E.coli黏附素亚单位疫苗在动物体内的免疫效果提供了一个安全有效的操作平台。
- 原志伟吴娟朱春红朱军郁磊羊扬王建业朱国强
- 关键词：F18大肠杆菌
- 大肠杆菌K99菌毛fan操纵子的克隆、表达及活性被引量：5
- 2012年
- 【目的】在体外克隆和表达猪产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K99菌毛操纵子fan结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性。【方法】以猪源分离的表达K99菌毛ETEC C83907株制取模板,成功PCR扩增出编码K99菌毛的fan操纵子,约5.7 kb。将fan操纵子克隆入表达质粒载体pBR322,筛选出含正确阳性质粒的重组菌。进一步将上述的重组质粒DNA转化至不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000株,同时将空载体pBR322质粒转化入SE5000构建阴性对照菌株。【结果】该重组菌能与鼠抗K99菌毛单克隆抗体发生明显的凝集反应,与新生仔猪小肠上皮细胞刷状缘BBV分子有强烈凝集反应。电镜观察到上述重组菌表面大量表达K99菌毛,用热抽提法提纯其表达的K99菌毛,并经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,可以得到分子量约为18.5kDa的主要蛋白条带。纯化菌毛免疫小鼠后制备出高效价的鼠抗血清,能与携带K99菌毛的C83907、C83914、C83260野生株发生强烈的凝集反应,而与携带其他菌毛的ETEC不反应。玻板凝集试验和Westernblot结果表明:体外表达的K99菌毛具有和野生K99菌毛相同的抗原性。用表达K99菌毛的重组菌进行HeLa细胞体外黏附试验和黏附抑制实验,结果表明:重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附性,而且用重组菌毛制备的鼠抗血清能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对细胞系的黏附结合。【讨论】本研究为进一步研究K99菌毛生物学作用建立了良好的实验平台。
- 羊扬厚华艳郁磊朱国强
- 关键词：产肠毒素大肠杆菌
- 重组质粒pACYC184-hok/sok的构建及稳定性研究被引量：2
- 2011年
- 以低拷贝质粒pACYC184为载体,将hok/sok基因插入到载体BamHⅠ位点,构建重组质粒pACYC184-hok/sok稳定系统,同时构建hok/sok基因缺失突变重组质粒pACYC184-hok/sok(M)。通过对构建的重组菌进行连续传代和对不同代次的重组质粒进行SphⅠ酶切,分析hok/sok基因的引入对宿主细胞生长的影响。结果表明,重组质粒pACYC184-hok/sok在无抗生素筛选压力下连续传代,传至第135代时质粒稳定率仍是100%,且传代前后的质粒SphⅠ酶切图谱没有发生变化,DNA序列测定表明,插入的hok/sok基因没有发生任何突变。突变重组质粒pACYC184-hok/sok(M)传代前后的质粒SphⅠ酶切结果虽没有发生变化,但其相应的重组菌传至第15代,质粒几乎完全丢失。生长曲线的测定结果表明,与含pACYC184重组菌生长曲线相似,pACYC184-hok/sok重组菌生长较快,而pACYC184-hok/sok(M)重组菌生长缓慢。以上结果表明,含hok/sok稳定系统,其稳定性明显高于无hok/sok稳定系统的质粒pACYC184以及突变质粒pACYC184-hok/sok(M)。重组质粒pACYC184-hok/sok具有良好的结构稳定性和分离稳定性。
- 康小燕蒋志伟郁磊羊扬舒燕姚丰华朱国强
- 关键词：PSK
- 产志贺毒素样大肠杆菌F18ab菌毛操纵子基因的体外非诱导系统的表达和鉴定
- 2012年
- 以产志贺毒素样大肠杆菌(SLTEC)F18ab血清型标准菌株107/86基因组DNA为模板,利用PCR技术成功扩增出编码F18ab完整菌毛操纵子fed基因,克隆入表达载体pBR322,经限制性内切酶酶切分析,DNA琼脂糖电泳鉴定并结合序列测定分析,构建和筛选出含fed完整基因正确插入的pBR322-fed重组质粒,将上述重组质粒转化至不含任何菌毛结构的大肠杆菌SE5000,该表达重组菌能分别与兔抗F18ab亚单位蛋白FedF高免血清、鼠抗F18ab菌毛a单因子单克隆抗体、兔抗F18ab菌毛高免血清和抗F18ab菌毛IgG抗体产生明显的凝集反应。用热抽提法分别抽提和纯化SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000(pBR322-fed)体外表达的F18ab菌毛,纯化菌毛经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色获单一相对分子质量约为15 000蛋白条带。Western-blotting结果表明:兔抗F18ab菌毛高免血清能特异性识别SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000(pBR322-fed)所提纯的单一主要结构蛋白。用重组菌SE5000(pBR322-fed)进行易感仔猪小肠上皮细胞体外黏附试验和黏附抑制试验,结果表明:重组菌SE5000(pBR322-fed)和SLTEC F18ab标准株107/86一样具有较强的黏附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而兔抗F18ab菌毛高免血清能有效地抑制上述重组菌SE5000(pBR322-fed)和SLTEC F18ab标准株107/86对易感仔猪小肠上皮细胞的黏附结合。
- 吴娟朱春红郁磊羊扬朱军舒燕包文斌吴圣龙Dieter M Schifferli朱国强
- 细菌hok/sok解离后致死系统研究进展
- 2011年
- 由于编码特定基因的重组质粒增加了细胞本身的代谢负担,因此,含有质粒的重组菌通常不稳定。质粒不稳定性（Plasnid instability）,包括分离不稳定性（Segregational instability）和结构不稳定性（Structural instability）两个方面,其中质粒的分离不稳定性是质粒不稳定性的主要因素。一旦丢失外源质粒,细胞将迅速增长，
- 蒋志伟康小燕郁磊朱国强
- 关键词：重组质粒解离细菌重组菌细胞
- 热敏肠毒素促进产肠毒素大肠杆菌对小肠上皮细胞系IPEC-J2的黏附的初步研究被引量：1
- 2012年
- 本试验利用PCR技术,以K88ac标准株C83902基因组DNA为模板扩增出热敏肠毒素(heat-labile toxins,LT)基因,大小约1.1 kb。将其克隆入表达质粒载体pACYC184,构建和筛选出含正确插入LT基因的pACYC-LT重组质粒。采用同样方法,构建和筛选出两种含点突变LT基因的重组质粒(pACYC-LT72和pACYC-LT192)。进一步将上述重组质粒DNA转化入不表达任何毒素的大肠杆菌SE5000株。GM1-ELISA结果表明,上述重组菌均能在体外正常表达LT毒素蛋白。以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型,比较了表达和不表达LT的细菌对细胞黏附性能。数据表明,LT的表达使细菌对肠上皮细胞的黏附效应明显增加(12.3±3.4倍)。两种LT毒素蛋白的单氨基酸突变体的表达证明了LT毒素的ADP核糖基化作用对其增强致病菌对肠细胞的黏附作用是必要的。蛋白激酶A的抑制剂Rp-cAMP、腺苷酸环化酶的抑制剂DDA和LT毒素的受体GM1都可阻断LT毒素对细菌黏附性能的提升作用。
- 郁磊吴娟朱国强
- 关键词：热敏肠毒素
- 产肠毒素大肠杆菌K88ab/K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性的初步研究被引量：2
- 2013年
- 为研究K88ab/K88ad菌毛对细胞的黏附作用,本研究分别以产肠毒素E.coli(ETEC)K88ab C83901株和K88ad C83903株基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增这两种K88菌毛操纵子fae基因(均约7.9 kb)。将其分别克隆于表达质粒pBR322中构建pBR-K88ab和pBR-K88ad重组质粒,并将其分别转化至不含任何菌毛的E.coli SE5000株中。该重组菌能够分别与鼠抗K88菌毛阳性血清和抗K88菌毛单克隆抗体(MAb)产生凝集反应;在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88菌毛。采用热抽提法提取其体外表达的K88ab和K88ad菌毛,SDS-PAGE电泳检测结果显示,菌毛蛋白的分子量约为26 ku。玻板凝集试验和western blot结果表明:重组表达的K88ab及K88ad菌毛与K88+参考株菌毛均能够被抗K88菌毛阳性血清和MAb识别。以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型进行黏附和黏附抑制试验,结果表明表达K88菌毛的重组菌及K88+参考株均能够黏附于IPEC-J2上皮细胞表面;而且阳性血清和MAb能够有效抑制重组菌或K88+参考株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。
- 郁磊吴娟朱军朱国强
- 关键词：产肠毒素大肠杆菌K88菌毛
