王振坤
- 作品数：10 被引量：71H指数：5
- 供职机构：东北农业大学更多>>
- 发文基金：黑龙江省海外学人科研资助项目国家自然科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 猪骨髓间充质干细胞的分离培养及核移植后重构胚胎发育能力的研究被引量：5
- 2008年
- 不同类型的细胞核移植效率不同,原因之一可能是不同类型细胞核移植后进行重编程的潜力不同。本实验对猪骨髓间充质干细胞(porcine bone marrow mesenchymal stem cells,pMSCs)体外分离培养的方法进行了优化,对猪骨髓间充质干细胞的增殖及生长特性进行了观察分析,并以其作为供体细胞进行核移植,对此类型细胞进行重编程的潜力进行了评估。结果表明用密度梯度离心法分离猪骨髓间充质干细胞优于全骨髓贴壁法;猪骨髓间充质干细胞数目在培养第6天达到峰值,传代培养10h时,贴壁率达到78.50%;传代培养后第4天分裂指数最高,为24.00‰;以猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)和猪胎儿成纤维细胞(PF)分别作为供核细胞构建核移植胚胎,其体外囊胚发育率分别为14.63%与15.07%(P>0.05),孤雌对照组囊胚发育率为30.91%(P<0.05);而三组囊胚细胞数分别为30.67±17.7、24.1±6.5和25.8±11.4(P>0.05)。实验表明,体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长增殖旺盛,生物学性状稳定,并适合作为核移植供体细胞。
- 王振坤田江天李秋明武美玲孔庆然郑重于学武雷蕾刘忠华
- 关键词：核移植
- 全细胞胞质内注射法生产猪重构胚的研究(简报)被引量：4
- 2008年
- 自从1997年克隆羊“Dolly”出生以来。体细胞核移植技术得到广泛应用,已经有十余种克隆哺乳动物出生，但克隆效率仍然很低。核移植方法的不够完善是其重要原因之一。传统的核移植方法——电融合法和胞质内注射法虽然都取得了成功。但还存在操作复杂及需要辅助设备等问题。为了能够找出一种既容易操作，又不需要特殊设备的核移植方法，本研究对胞质内注射技术进行了改进,尝试了一种新的核移植方法——非Piezo辅助的全细胞胞质内注射法，即不通过Piezo辅助。不破坏供体细胞膜直接将供体细胞注入卵母细胞内，并且比较了这种方法与电融合法对猪体细胞核移植效率的影响。探讨了非Piezo辅助的全细胞胞质内注射法在猪体细胞核移植上的可行性。
- 孔庆然罗一博田江天王振坤张力刘忠华
- 关键词：体细胞核移植
- 利用亮甲酚蓝染色筛选优质猪卵母细胞被引量：3
- 2009年
- 目的利用亮甲酚蓝（BCB）染色提高猪体外胚胎培养体系的效率。方法对猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）进行BCB染色,观察染色后猪卵母细胞成熟率和早期胚胎发育能力并进行分析。结果着色组（BCB＋）猪卵母细胞达到减数分裂Ⅱ（MⅡ）期的比率（91.6%）显著高于未着色组（BCB-）（64.0%）和对照组猪卵母细胞（77.5%）（P〈0.05）;BCB＋孤雌猪胚胎的囊胚率（34.9%）显著高于BCB-（9.5%）和对照组（23.1%）（P〈0.05）;BCB＋核移植猪胚胎的囊胚率（23.0%）显著高于BCB-（5.0%）和对照组（14.1%）（P〈0.05）。结论BCB染色是一种有效筛选具有较强发育能力猪卵母细胞的方法。
- 田江天王振坤郑重孙爽徐萌刘忠华
- 关键词：卵母细胞核移植
- 应用双重PCR技术鉴定猪胎儿性别及其细胞系建立被引量：5
- 2008年
- sry和zfy/x是与哺乳动物性别决定有关的重要基因。本试验针对猪sry基因设计了两对PCR引物,以zfy/x为内参基因,利用双重PCR技术对6只30d左右猪胎儿的性别进行鉴定。结果表明,所有的6个样品都有447bp(雄性)或445bp(雌性)的zfy或zfx序列的扩增带,而采用两对不同的引物对sry序列扩增后,有1个样品出现241bp和166bp的扩增带为雄性,其余的无特异性扩增带为雌性,然后采用胶原酶消化培养法建立已知性别的猪胎儿成纤维细胞系。该方法具有简单、快速、准确的特点,为转基因克隆动物研究中尽早转染目的基因以及培养特定性别的胎儿成纤维细胞系提供了可靠的依据。
- 尹智孔庆然格日乐其木格王振坤张力刘忠华
- 关键词：双重PCRSRY性别鉴定
- 体细胞核移植克隆民猪:培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响被引量：21
- 2007年
- 体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源,卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切.为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量,进而提高体细胞核移植猪的成功率,本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T),分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养,以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准,研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响.T,T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%,(69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%,添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率;3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著,但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25).来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管,其中有3头受体母猪妊娠发育到期,获得克隆民猪14头,其中有6头健康成活至今.实验结果表明,培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量,在含有10%pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.
- 刘忠华田江天郑重王振坤宋军尹智高力马海鹍孔庆然孙爽李玉田王洪斌
- 关键词：体细胞核移植体外成熟胎牛血清
- 东北民猪体细胞核移植及绿色荧光蛋白转基因猪研究
- 刘忠华李玉田王洪斌宋军尹智田江天郑重王振坤孔庆然孙爽马海鲲高力范洪刚
- 该研究针对猪体细胞核移植的特殊性，为建立稳定的体细胞核移植猪的技术体系以及基于体细胞核移植的转基因猪技术体系，主要开展了如下的研究内容：卵母细胞体外成熟培养体系建立；东北民猪、大白猪和长白猪体细胞采集培养及冷冻保存；体细...
- 关键词：
- 关键词：克隆猪核移植
- 猪骨髓间充质干细胞分离培养及其核移植胚胎发育潜能研究
- 本实验以不同的方法分离培养了猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)，对分离培养的pMSCs生物学特性进行了分析，并以pMSCs为供核细胞进行了核移植实验，通过重构胚的体外发育能力研究了pMSCs的发育潜能：以人骨髓间充质干细胞...
- 王振坤
- 关键词：胚胎发育细胞培养细胞核移植
- 文献传递
- 大鼠胚胎干细胞系的建立及向神经干细胞分化潜能的研究
- 大鼠是一种非常有价值的研究病理和药理的模型动物。因此建立一种稳定的大鼠胚胎干细胞(rES)分化体系对于分析rES早期发育、基因功能以及应用于基因打靶制作人类疾病动物模型非常必要。尽管具有生殖系遗传能力的rES细胞系已经被...
- 王振坤
- 关键词：神经干细胞神经分化体外分化
- 利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究被引量：12
- 2008年
- 试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。
- 宋军王振坤孔庆然赵祥杰刘丽清田江天郑重孙爽尹智刘忠华
- 关键词：转基因绿色荧光蛋白核移植脂质体
- 体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪被引量：27
- 2008年
- 体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法.绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础.本研究对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究.结果显示,采用4.0μL/mL脂质体转染试剂,1.6μg/mL质粒DNA,转染6h可以获得最佳的转染效果,转染效率达3.61%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%;重构胚移植于10头受体后,有5头妊娠,3头受体发育到期,共出生克隆猪6头,其中4头为GFP阳性,经DNA检测确认为GFP转基因猪;转基因克隆胚胎移植出生率为1.0%,阳性个体出生率为0.7%.结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能.本研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值.
- 刘忠华宋军王振坤田江天孔庆然郑重尹智高力马海鹍孙爽李玉田王洪斌
- 关键词：转基因绿色荧光蛋白核移植脂质体
