- 五聚体辅助胰腺癌黏蛋白4抗原HLA限制性CTL表位筛选
- 2010年
- 目的 筛选和验证黏蛋白4（MUC4）的有效抗原表位并证实MUC4抗原表位在体内的自然递呈作用.方法 采用生物信息学方法预测、T2细胞体外实验初步筛选后,通过人类组织相容性抗原（HLA）表位肽负载树突状细胞（DC）、酶联免疫斑点试验、细胞毒T淋巴细胞（CTL）试验验证相应表位的体外HLA限制性免疫效应;合成MUC4 HLA-A2限制性表位五聚体;采用该五聚体检测临床胰腺癌患者体内自然递呈的MUC4表位.结果 通过多参数表位预测得到了5个HLA-A＊0201限制性表位并合成抗原肽,并经T2细胞稳定性试验初步验证;体外实验中,肽P1126诱导的CTL在不同的效靶比可特异性杀伤P1126负载的T2细胞和MUC4＋、HLA-A2＋的癌细胞株HCT-116;能够产生IFN-γ的细胞数（130.3±6.6）明显高于阴性对照组.五聚体检测发现,MUC4（＋）患者外周血检出特异性CTL的频率显著高于MUC4（-）患者;但MUC4（＋）患者中,HLA-A2（＋）患者外周血检出特异性CTL的频率与HLA-A2（-）患者的差异无统计学意义.结论 肿瘤相关抗原MUC4的HLA-A＊0201限制性CTL表位P1126,能诱导人外周血单核细胞的CTL反应,该活化的CTL能分泌免疫活性物质诱导特异性靶细胞的凋亡.P1126能在胰腺癌患者外周血中自然递呈,但HLA限制性不完全.
- 高文涛张静静朱毅卫积书孟凯陈建敏吴俊立苗毅
- 关键词：胰腺肿瘤单核细胞
- PADRE/MUC4重组腺病毒转染树突状细胞诱导特异性CTL体外杀伤作用研究
- 2007年
- 目的:观察PADRE/MUC4重组腺病毒转染树突状细胞(DC)诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)及体外特异性杀伤作用。方法:pAd-CMV-PADRE/MUC4转染HLA-A2健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)来源的未成熟DC,TNF-α诱导成熟后与自体PBMC混合培养刺激3周,Cr51和Elispot实验检测CTL体外杀伤活性。结果:Cr51和Elispot检测结果显示PADRE/MUC4转染DC可以诱导产生特异性CTL,而pAd-CMV-GFP组和空白对照组不能产生有效特异性CTL。结论:腺病毒载体介导多表位嵌合基因(PADRE/MUC4)转染未成熟DC,在体外可以诱导产生特异性CTL,对表达MUC4肿瘤细胞具有杀伤效应。
- 吴峻立卫积书孟凯高文涛陈建敏张静静朱毅苗毅
- 关键词：腺病毒树突状细胞细胞毒性T淋巴细胞
- 肿瘤抗原MUC4 HLA-A ^＊0201限制性CTL表位的体外免疫效应研究
- 2007年
- 目的:探讨肿瘤抗原MUC4 HLA-A *0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽负载树突状细胞诱导CTL的体外免疫效应。方法:从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC)。用之前表位预测法预测并合成的五种肽分子分别脉冲成熟的DC,并刺激HLA-A *0201+健康人自体CD8+T细胞成为CTL。用酶联免疫斑点法(ELISPOT),检测CTL IFN-γ的分泌。同时用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其对靶细胞的杀伤作用。结果:人PBMC可在多种细胞因子的作用下被诱导称为DC。肽P01204诱导的CTL,在不同的效靶比可特异性杀伤P01204脉冲的T2细胞[5∶1时为(9.03±0.24)%,10∶1时为(19.62±0.44)%,20∶1时为(27.93±2.22)%]和MUC4+、HLA-A2+的HCT-116细胞[5∶1时为(7.26±0.18)%,10∶1时为(16.83±0.40)%,20∶1时为(25.23±1.35)%],均高于阴性对照组(P<0.05),能够产生IFN-γ的细胞数(130.33±6.58)明显高于阴性对照组(P<0.05)。结论:肿瘤相关抗原MUC4的HLA-A *0201限制性CTL表位P01204,能诱导人外周血单核细胞的CTL反应,该活化的CTL能分泌免疫活性物质诱导特异性靶细胞的凋亡。
- 孟凯吴峻立高文涛苗毅
- 关键词：MUC4细胞毒性T淋巴细胞酶联免疫斑点法
- 胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因重组腺病毒载体的构建及其在COS-7细胞的表达
- 2007年
- 目的:构建含有胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因的腺病毒载体,并转染真核细胞COS-7。方法:多参数分析预测MUC4抗原HLA-A1、HLA-A2限制性CD8+T细胞表位kozac序列、引导序列以及通用Th表位PARDE和多表位基因串连后合成嵌合全基因。嵌合基因克隆到腺病毒穿梭载体pAdshuttle-CMV获得重组质粒pAdshuttle-CMV-PE。酶切鉴定后,将正确的重组质粒转化含有腺病毒骨架载体的BJ5183菌进行同源重组。PacⅠ酶切和测序鉴定正确的重组子,脂质体介导转染Ad293细胞,通过观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达和PCR扩增目的基因的方法鉴定重组腺病毒(rAd-PE)。Ad293细胞反复感染冻融扩增病毒,流式细胞仪和TCID50检测病毒滴度。病毒颗粒感染COS-7细胞,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白的表达以及SDS-Page分析多表位嵌合蛋白的表达。结果:成功构建了含有胰腺癌MUC4的多表位嵌合基因重组腺病毒,病毒滴度为1×1010pfu/ml。SDS-Page发现在16kD处有一符合预期大小的蛋白表达。结论:该重组腺病毒成功构建并能够在真核细胞COS-7中表达,为下一步胰腺癌的肿瘤疫苗研究奠定相应的基础。
- 高文涛卫积书吴竣立孟凯苗毅
- 关键词：腺病毒载体MUC4嵌合基因肿瘤疫苗
