吴云飞
- 作品数：11 被引量：57H指数：4
- 供职机构：四川农业大学更多>>
- 发文基金：四川省科技支撑计划教育部“新世纪优秀人才支持计划”四川省青年科技基金更多>>
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- 猪细小病毒四川株的分离鉴定及其一步生长曲线
- 2013年
- 为了研究猪细小病毒(PPV)的增殖规律,利用PK-15细胞从流产胎儿的肝、肠系膜淋巴结和肾样品中分离到1株病毒,经PCR检测、蚀斑纯化、病毒理化试验、微量中和试验和血凝试验证实该分离株为猪细小病毒,命名为SC-L。针对PPV的VP1和NS1基因设计特异性引物,建立PPV的荧光定量PCR方法。以SC-L分离株感染PK-15细胞,感染后每隔4h分别收集感染细胞与上清液,利用荧光定量PCR方法对不同样品中的病毒DNA进行定量分析,绘制PPV SC-L的一步生长曲线。PPV SC-L株感染PK-15细胞,细胞外病毒含量在第4～20小时缓慢增加,20h后呈对数增长,第56小时达到最大值,随后病毒含量迅速下降,在第68小时时趋于稳定;在细胞内感染4h检测到微量的病毒粒子,第4～24小时细胞内病毒缓慢增长,24h细胞内病毒粒子呈对数增长,第44小时达到最大量,随后胞内病毒粒子逐渐降低。表明PPV在细胞内增殖到一定数量后逐步释放到细胞外,且细胞外病毒最大量高于细胞内。
- 江一帆吴云飞朱玲徐志文阳爱国廖珊陈蕾黄仆郭万柱
- 关键词：猪细小病毒实时荧光定量PCR
- 猪细小病毒PK-15细胞适应株的培育及增殖特性被引量：8
- 2013年
- 为了研究猪细小病毒不同接毒方式的增殖规律及在不同细胞的病毒含量差异。本实验利用PK-15细胞对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)分离株进行适应性培养。针对PPV的NS1基因设计特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法。利用该方法检测PPV分离株同步和分步接毒的病毒含量,绘制一步生长曲线;同时检测PPV在HeLa、MDBK、PK-15、ST、F81、BHK-21和Marc-145细胞上的增殖特性。结果显示,PPV分离株盲传至12代产生CPE,继续传代培养10代仍能产生稳定的细胞病变,成功培育出PK-15细胞适应株。一步生长曲线显示,分步接毒的病毒含量高于同步接毒,而增殖周期短于同步接毒;PPV在不同细胞的增殖结果显示,各细胞开始出现CPE的时间依次为PK-15、ST、HeLa和MDBK,病毒含量高低依次是ST、PK-15、MDBK和HeLa,而不能在F81、BHK-21和Marc-145细胞上增殖。本实验首次利用荧光定量PCR方法成功分析PPV不同接毒方式的增殖规律及不同细胞的增殖特性,为PPV基础研究和疫苗生产提供资料。
- 吴云飞朱玲徐志文付梦瑾陈蕾阳爱国郭万柱
- 关键词：猪细小病毒实时荧光定量PCR
- 伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及增殖特性被引量：26
- 2013年
- 利用PK-15细胞从四川某猪场分离到1株病毒,经PCR检测、蚀斑纯化、病毒理化试验、血清学试验和动物回归试验证实,该分离株为伪狂犬病病毒(PRV),遂将其命名为PRV-SL;用其分别感染PK-15、Vero、Marc-145、Hela、BHK-21和MDBK细胞,观察病变情况及绘制PRV-SL株在不同动物细胞的一步生长曲线;用TCID50法检测PRV-SL株不同细胞毒的病毒效价。结果显示,PRV-SL株在细胞中均能增殖,但不同细胞之间CPE及病毒效价有所差异:PRV-SL株感染PK-15细胞的病毒效价最高;病毒一步生长曲线显示,PRV-SL株感染BHK-21细胞的隐蔽期最短,在猴源细胞(Vero、Marc-145)上增殖周期最长,增殖周期由短至长依次为BHK-21、MDBK、Hela、PK-15、Vero和Marc-145细胞。结果表明,PRV-SL株具有泛嗜性,在不同动物细胞上的增殖效价和增殖曲线具有明显差异,病毒在不同细胞上的增殖周期长短与病毒效价高低无相关性。
- 吴云飞朱玲徐志文周远成魏浩澈杨雪郭万柱
- 关键词：伪狂犬病病毒
- 猪巨细胞病毒四川株gB基因的克隆表达及抗原性分析
- 2012年
- 为研究猪巨细胞病毒(PCMV)SC株gB蛋白的免疫学活性,采用PCR扩增PCMV SC株gB全基因和不含跨膜区及信号肽的gB基因片段,将后者克隆至pET-30a(+)载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导以获得高效表达。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,分别用琼脂扩散试验和Western-blot对多克隆抗体和复性的gB蛋白进行检测。结果显示,扩增的PCMV gB基因全长2 580bp,编码860个氨基酸。与国内外参考株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.8%～99.5%和96.6%～99.0%;与其他9株β疱疹病毒核苷酸和氨基酸序列相似性分别为33.3%～41.4%和13.3%～49.4%;系统进化分析显示,PCMV与人疱疹病毒6型和7型属于一个分支。gB肽链N端1～23位氨基酸为信号肽,729～751位氨基酸间含有跨膜区。构建的表达载体pET30a-gB-B在Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后以包涵体形式表达出大小约80ku的蛋白。所制备的血清琼扩抗体效价为1∶16,Western-blot显示重组gB蛋白可与PCMV阳性猪血清反应。结果表明,PCMV gB基因较为保守,与国内外不同地区的PCMV毒株具有较高的相似性,所表达的重组蛋白具有很好的抗原性。
- 朱玲史小红王潇娣梅淼周远成刘孟良吴云飞徐志文郭万柱
- 关键词：GB基因原核表达抗原性
- 猪嵴病毒RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：9
- 2013年
- 根据GenBank中猪嵴病毒(porcine kobuvirus)3D-RNA聚合酶基因序列设计并合成了1对特异性引物,建立了一种猪嵴病毒RT-PCR检测方法。反应产物测序结果与GenBank中猪嵴病毒SH-W-CHN/2010/China株比较,基因序列同源性为93%。利用该方法对猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、链球菌、猪巴氏杆菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验表明,该方法最低能检测到的病毒核酸含量为1pg。利用所建立的RT-PCR方法检测采集自我国四川地区123份临床样品,结果阳性率为59.3%,表明猪嵴病毒在四川地区猪群中流行率较高。
- 李淞朱玲周远成吴云飞陈蕾徐志文郭万柱
- 关键词：RT-PCR
- 猪溶血性链球菌的分离鉴定及溶血素基因的PCR检测被引量：1
- 2012年
- 为了建立简便、快捷、准确的猪溶血性链球菌实验室诊断方法,试验采用无菌操作技术将疑似猪链球菌病的猪组织接种于血平板上培养,对染色、镜检为链球菌的菌落进行分离纯化,然后进行生化鉴定、动物致病性试验、药敏试验。根据GenBank发布的猪链球菌溶血素基因(sly)全序列,设计1对特异性引物,然后抽提分离菌DNA扩增出大小为568 bp的目的片段。结果表明:使用此鉴定方法可简便、快捷、准确地检测出猪溶血性链球菌溶血素基因。
- 徐珊珊黄仆刘涛代洪波吴云飞刘孟良朱玲
- 关键词：溶血性链球菌溶血素基因PCR检测
- A型流感病毒在猪群中的流行情况
- 2013年
- 根据病毒内部核蛋白（NP）和基质蛋白（M）抗原性的不同，流感病毒可分为A、B、C3种类型，其中A型是造成流行的主要病原。A型流感病毒广泛分布于世界各地的猪群中，通过猪体流感病毒可完成禽一猪一人的传播过程，已有很多文献记载其发生过多次种间传播。当前，科研工作者和公众对A型流感病毒的关注不仅仅限于兽医学意义，更在于其潜在的公共卫生意义。本文对现有的关于A型流感病毒在猪群中传播的报道进行回顾，同时着重阐述其在猪种群内和种群之间的传播途径和影响传播的因素。
- 魏浩澈季宏伟徐志文周远成陈蕾吴云飞
- 关键词：A型流感病毒猪群公共卫生意义基质蛋白种间传播
- 四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查被引量：6
- 2015年
- 为了解2012-2013年四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异背景和分子流行病学情况,对PRRSV阳性病料中的Nsp2、ORF5基因进行RT-PCR扩增和序列测定,所获得的序列分别与美洲型代表株(VR2332)、欧洲型代表株(LV)、标准毒株和变异毒株进行相似性分析。结果本研究成功获得8条Nsp2基因序列和17条ORF5基因序列,序列分析表明所有PRRSV流行毒株均属于美洲型,其中8株Nsp2基因序列与标准毒株和变异毒株的核苷酸相似性分别为75.2%~88.6%和94.8%~97.1%,推导的氨基酸相似性分别为58.7%~79.2%和92.8%~94.8%;17株ORF5基因序列与标准毒株和变异毒株的核苷酸相似性分别为90.1%~96.6%和95.6%~99.4%,推导的氨基酸相似性为77.2%~93.0%和88.0%~96.8%;与标准毒株相比,8株Nsp2基因有30个不连续氨基酸缺失,17株ORF5基因序列有点突变。从遗传进化分析看,所有流行毒株均属于PRRSV亚群Ⅲ。
- 蔡雨函杨雪徐志文郭万柱周远成吴云飞杨文宇朱玲
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因ORF5基因
- PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性被引量：3
- 2012年
- 为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。
- 梅淼陈燕凌朱玲熊丁杰郭万柱王颖旺吴云飞徐志文
- 关键词：VP2基因ORF2基因B细胞表位
- 猪输血性传播病毒2型全基因组的克隆与序列分析被引量：2
- 2011年
- 为了监测猪输血性传播病毒2型(TTV2)的疫源和进化情况,为进一步研究TTV2的形态结构、遗传变异和基因功能奠定生物学基础,参照国外发表的猪输血性传播病毒(TTV)全基因组核苷酸序列(GU456386.1),设计3对特异性引物,采用巢式PCR对采自四川省的疑似猪输血性传播病毒感染的血清样品进行TTV全基因组的克隆、测序和拼接,并对其进行同源性分析和遗传进化分析。结果显示,该基因组全长2 802bp,与国内外参考株同源性介于87%～96%之间,ORF1的同源性介于81%～95%;ORF2的同源性较高,介于93%～99%之间。系统进化树分析表明,该分离株与美国株PTTV2c-VA的同源性高达96%。结果表明,该毒株为TTV2,与国内外参考株有一定的相似性。
- 赵玲徐志文朱玲梅淼吴云飞
- 关键词：克隆
