韩世通
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 供职机构：同济大学传染病与疫苗研究所更多>>
- 发文基金：中央高校基本科研业务费专项资金国家自然科学基金更多>>
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- 一种改良的恶性疟原虫核蛋白和胞浆蛋白分离方法的建立
- 2013年
- 目的建立一种改良的恶性疟原虫核蛋白和胞浆蛋白分离方法，并对分离的蛋白组分进行分析和鉴定。方法分别用含不同盐浓度的裂解缓冲液和不同研磨次数提取核蛋白和胞浆蛋白，并利用针对不同组分特异性蛋白的抗体进行Westernblot，分析分离效果。结果含50mmol／LNaCl的裂解缓冲液和研磨100～150次为分离核蛋白和胞浆蛋白最佳条件，恶性疟原虫醛缩酶胞浆蛋白和组蛋白3核蛋白的抗体Westernblot、抗GFP抗体Westernblot及活细胞免疫荧光检测均表明该方法效果良好。结论建立了一种快速、有效的恶性疟原虫核蛋白和胞浆蛋白的分离方法（裂解液盐浓度为50mmol／L，研磨100150次），为研究恶性疟原虫蛋白的胞内分布以及蛋白质／蛋白质／核酸相互作用提供了重要的技术手段。
- 韩世通张青锋潘卫庆
- 关键词：核蛋白
- 恶性疟原虫ApiAP2蛋白与var基因内含子序列相互作用的体内鉴定被引量：3
- 2014年
- 目的鉴定恶性疟原虫ApiAP2蛋白家族成员PF3D7_1107800与var基因内含子保守序列(iNPE)存在体内相互结合作用。方法提取恶性疟原虫标准株3D7基因组DNA,PCR扩增PF3D7_1107800基因5′端片段。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pGex-4T-1,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况,谷胱甘肽亲和层析纯化重组蛋白。20只BALB/c小鼠分为重组蛋白免疫组和PBS对照组,每组10只,免疫组小鼠每鼠背部皮下注射纯化的重组蛋白100μl(约含蛋白20μg),对照组小鼠注射等量PBS,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周处死小鼠,收集血清。重组纯化蛋白G(Protein G)纯化2组小鼠血清,Western blotting鉴定免疫血清抗体情况。染色质免疫沉淀(ChIP)获得恶性疟原虫DNA,qPCR检测PF3D7_1107800蛋白抗体组在C类var基因的内含子区域的富集情况。结果 PCR扩增PF3D7_1107800基因5′端片段结果显示,在约345 bp处有一特异性条带,与理论值相符。重组表达载体pGEX-4T-1-PF3D7_1107800N经测序表明构建成功。重组蛋白经诱导表达和纯化后,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,所获的重组蛋白为目的蛋白,其相对分子质量(Mr)约为37 000,与预测值一致。重组蛋白免疫小鼠后,获得抗体血清,Western blotting分析结果显示,血清中抗体可与重组蛋白特异结合,在约Mr200 000处有一目的条带,与预测值一致。ChIP实验产物经qPCR分析显示,在var基因内含子区域的相对富集程度为内参seryl-tRNA合成酶基因区域的2倍以上。结论恶性疟原虫ApiAP2家族成员PF3D7_1107800可在体内与C类var基因内含子区域结合。
- 韩世通张青锋潘卫庆
- 关键词：恶性疟原虫
