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BMMYA'平板-Fast blue RR顶层琼脂法高效筛选高酶活脂肪酶: 2012年; 摘建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶菌株的平板方法。该方法以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA'平板-FastblueRR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛菌株接种至含有2%甲醇的BMMYA'平板上,30℃生长并诱导4～5 d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1 h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顶层琼脂。2 min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株。该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90%。; 王睿喻晓蔚沙冲徐岩; 关键词：FAST BLUE 高温处理

定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力被引量：15: 2009年; 运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。; 王睿喻晓蔚沙冲徐岩; 关键词：定向进化易错PCR

PCR依赖型方法构建高质量酵母基因突变文库被引量：2: 2011年; 针对定向进化中利用亚克隆的方法建立酵母突变文库建库周期长、效率低、库容量低、丰度低等问题,建立了一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的新方法。步骤为：构建目标基因的重组表达质粒;以此为模版,设计长引物片段,PCR/易错PCR/DNA Shuffling等方法扩增得到两端带有与表达载体40~70 bp同源序列的突变基因;再利用PCR扩增得到表达载体;将扩增得到的目标基因和表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母,目标基因和表达载体在酵母体内同源重组成为完整的表达盒,整合入酵母基因组,获得基因突变文库。对构建的突变文库进行筛选,分别得到了酶活、蛋白表达量及热稳定性提高的突变株。该方法为完全PCR依赖型（PDM）,在体内构建表达盒,效率高,操作方便,将建库周期由2周缩短为3 d,将库容量从传统的103~104提高到105以上,库阳性率达到95%。; 王睿喻晓蔚徐岩郅岩孔宇; 关键词：同源重组毕赤酵母

易错PCR提高华根霉脂肪酶的热稳定性被引量：1: 2013年; 为了提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的热稳定性,运用定向进化-易错PCR的方法,经两轮易错PCR引入突变,利用fast-blue RR顶层琼脂法对突变文库进行筛选,第一轮易错PCR后筛选到2株突变菌株,第二轮筛选到4株突变株。第二轮最佳突变株Ep2-4,其中3个氨基酸发生了突变:A129S、P168L和V329A。该突变酶ep2-4在60℃下半衰期相对原始酶r27RCL提高5.4倍,T50值提高7.8℃。酶学性质研究表明,突变酶ep2-4在热稳定性提高的基础上,仍保有良好的催化活性。蛋白质三维结构模拟显示,突变A129S可以和Gln133形成氢键,增加了酶表面的亲水性和极性;P168L可以与邻近的Leu164形成疏水键,导致突变酶的热稳定性提高。; 王睿喻晓蔚徐岩; 关键词：定向进化易错PCR 热稳定性毕赤酵母

理性设计二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性被引量：6: 2018年; 【背景】华根霉脂肪酶的工业应用前景广泛,但是受到酶热稳定性较差的限制。【目的】对华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶r27RCL分子结构进行理性设计,以提高该酶热稳定性。【方法】以Disulfide by design软件筛选r27RCL分子表面能够形成二硫键的突变位点,共得到7对二硫键突变。利用全质粒PCR进行定点突变,并在毕赤酵母中表达获得突变酶。【结果】最佳突变酶m9/10 (S85C-Q145C)与野生型酶r27RCL相比,60°C下的半衰期分别提高了4.5倍,T_m值提高了4.2°C,而催化活性保持不变。蛋白质晶体结构模拟显示,位于β2折叠上的85C和位于α4螺旋上的145C可形成二硫键,从而提高酶的热稳定性。【结论】酶分子中引入新增二硫键可以显著提升酶的热稳定性。; 王睿喻晓蔚喻晓蔚; 关键词：热稳定性二硫键

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王睿