王吉鹏
- 作品数：9 被引量：8H指数：2
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- 金诺芬抗日本血吸虫活性机制及其细胞毒性的探讨被引量：1
- 2012年
- 目的探讨金诺芬对日本血吸虫（Schistosoma japonicum）童虫和成虫作用效果的差异及其作用靶点，测定金诺芬对宿主细胞的毒性。方法用二硫苏糖醇（DTI？）／胰岛素还原法体外测定金诺芬对重组sjTrx-酶活性的影响。用日本血吸虫尾蚴感染4～6周龄雌性昆明鼠（童虫组10只小鼠，600-800条／只；成虫组10只小鼠，80-100条／只）．灌注法收集童虫（15d）和成虫（35d）。虫体经无菌生理盐水充分洗涤后，转移至预先添加培养基的12孔板中．分别加入金诺芬和吡喹酮至其终浓度为1、5和10μg／ml，显微镜下观察化合物处理2、24、48和72h后虫体的形态改变和死亡情况。CCK．8试剂盒测定金诺芬（5和10Ixg／m1）对3种人源宿主细胞（HepG2、293T和Hela）的毒性。结果10μg／ml金诺芬作用下，40min内重组Si协．1还原胰岛素的总量减少54．5％。5μg／ml金诺芬体外作用24h后．成虫死亡率达75％，而童虫未见死亡；10μg／ml金诺芬作用72h后，童虫和成虫均全部死亡，但童虫死亡时间较成虫延迟。金诺芬和吡喹酮作用后，光镜下观察．虫体均出现颜色变灰暗、挛缩和卷曲等现象：电镜下可见虫体表被膜结构严重破坏。细胞毒性测试结果显示，5μg／ml金诺芬可使细胞相对活力降低85％以上，而10μg／ml时细胞几乎全部死亡。结论sjTrx-是金诺芬作用靶点之一。金诺芬具有较强的细胞毒性作用，对日本血吸虫成虫和童虫的作用效果存在差异．对成虫的作用效果更显著。
- 刘建胡薇徐斌王吉鹏王树奇王小宁
- 关键词：金诺芬日本血吸虫靶点细胞毒性
- 一种化合物在制备抗日本血吸虫病的药物中的应用
- 本发明公开了一种结构式（I）化合物在制备抗日本血吸虫病的药物中的应用。本发明通过对日本血吸虫脂肪酸合成途径的深入分析，认为参与该途径的3-氧化酰基-酰基载体蛋白还原酶（3-Oxoacyl-ACP Reductase，OA...
- 胡薇刘建王吉鹏王树奇杨忠徐斌鞠川
- 文献传递
- 一种化合物在制备抗日本血吸虫病的药物中的应用
- 本发明公开了一种结构式（I）化合物在制备抗日本血吸虫病的药物中的应用。本发明通过对日本血吸虫脂肪酸合成途径的深入分析，认为参与该途径的3-氧化酰基-酰基载体蛋白还原酶（3-Oxoacyl-ACP Reductase，OA...
- 胡薇刘建王吉鹏王树奇杨忠徐斌鞠川
- 文献传递
- 日本血吸虫醛糖还原酶基因RNA干扰效应的初步研究被引量：4
- 2014年
- 目的研究siRNA诱导的日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)基因转录本和蛋白水平的RNA干扰(RNAi)效应。方法设计并合成2条针对SjAR基因的siRNA(siRNA-1和siRNA-2)和1条阴性对照siRNA(siRNA-NC)。用日本血吸虫尾蚴感染4~6周龄雌性昆明鼠(800~1 000条/鼠),13 d后灌注小鼠肝门静脉收集童虫,每(120±10)条童虫为一组,分别采用电转法和浸泡法对各组童虫进行RNAi处理。电转处理法:向电击杯中分别加入5μg siRNA-1、siRNA-2、siRNA-NC或等体积的焦碳酸二乙酯(DEPC)水(空白对照),经125 V 20 ms方波脉冲电击童虫1次后,继续培养48 h;浸泡处理法:向童虫培养基中加入siRNA-1、siRNA-2或siRNA-NC溶液至siRNA浓度为200 nmol/L,第3天时更换一半新鲜培养基并补充siRNA,共培养5 d。每处理设3个平行对照组。干扰结束后,采用TRIzol法提取虫体RNA和可溶性总蛋白,将RNA反转录为cDNA,以SjGAPDH基因为内参,实时定量PCR检测SjAR转录本相对表达水平的变化,Western blotting分析SjAR蛋白水平的变化。结果实时定量PCR结果显示,采用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC电转后,虫体SjAR转录本水平分别为(90.6±16.2)%、(84.2±7.3)%和(105.9±10.3)%,与空白对照组[(100.9±16.8)%]的差异均无统计学意义(P>0.05);使用siRNA-1、siRNA-2浸泡后,SjAR转录本水平为(48.6±8.2)%和(73.4±4.7)%,均较空白对照组[(100.0±3.3%)]显著下降(P<0.01),而阴性对照siRNA-NC浸泡后的虫体SjAR转录本的表达水平为(101.43±14.33)%,与空白对照组比较表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting分析和条带定量结果显示,以空白对照组为标准,使用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC浸泡后,SjAR蛋白水平分别为79.0%、97.8%和103.2%。结论使用浸泡法对日本血吸虫童虫SjAR进行RNAi处理可降低靶基因转录本和蛋白的表达水平。
- 王树奇徐斌刘建王吉鹏胡薇
- 关键词：日本血吸虫醛糖还原酶RNA干扰
- 日本血吸虫表皮生长因子受体基因的鉴定和功能研究
- 2020年
- 目的鉴定日本血吸虫表皮生长因子受体基因(SjEGFR),并阐明其在日本血吸虫生长和生殖发育中的作用。方法通过5’-RACE和3’-RACE扩增、测序获取SjEGFR基因全长片段。采用荧光定量PCR(qPCR)技术检测该基因在日本血吸虫不同发育阶段(16、18、20、22、24、26 d)表达情况。使用整条虫体原位杂交法对感染24 d的日本血吸虫雌、雄虫SjEGFR基因转录本进行定位。通过体内持续RNA干扰(RNAi)技术特异性敲低SjEGFR基因,待虫体发育至30 d收集虫体。统计分析雌、雄虫回收数量以及虫体长度,通过明矾卡红染色观察虫体生长发育情况。结果首次鉴定了SjEGFR基因,其结构具有一个保守的酪氨酸激酶位点。整条虫体原位杂交定位显示该基因转录本在虫体各处均有表达,在雌、雄虫肠道部位呈现出明显着色的高表达。体内RNAi显示,SjEGFR基因表达被特异性敲低后,雌、雄虫生长受阻。RNAi组雌虫子宫内无虫卵,肠道内无色素沉积、卵黄腺发育迟滞、卵巢发育受阻;雄虫呈现睾丸个数减少、体积变小,出现了更多未成熟的精母细胞。结论特异性敲低SjEGFR基因表达可影响日本血吸虫生长和生殖发育,阻滞虫卵产生。
- 相慢玉李健罗芳孙成松朱炳宽王吉鹏莫筱瑾张颋徐斌冯正胡薇
- 关键词：日本血吸虫表皮生长因子受体生殖
- 日本血吸虫钙蛋白酶基因的原核表达及功能分析被引量：1
- 2014年
- 目的克隆表达日本血吸虫钙蛋白酶(Sjcalpain),了解Sjcalpain在尾蚴内的分布及其在尾蚴侵染中的作用。方法根据SjCalpain基因全序列(GenBank登录号为AB016726)设计引物,PCR分别扩增Sjcalpain的催化位点区域和Ca2+结合位点区域的基因片段,克隆入pET-28a原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中进行原核表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达和纯化情况。纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体,ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测多克隆抗体的效价和特异性。利用免疫荧光定位技术观察Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况。将尾蚴和钙蛋白酶抑制剂孵育后感染小鼠,计算血吸虫减虫率。结果成功构建了Sjcalpain的催化位点/pET-28a和Ca2+结合位点/pET-28a原核表达重组质粒,在E.coli BL21(DE3)中成功表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为43 000和39 000,与预期大小一致,且均为包涵体表达。组氨酸标签亲和层析成功纯化得到目的重组蛋白。间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价超过1∶80 000。免疫定位结果显示,Sjcalpain在日本血吸虫尾蚴头部分布较多。尾蚴侵染抑制实验中,钙蛋白酶抑制剂作用组平均获虫19条,对照组平均获虫23条,减虫率为17.4%。结论 Sjcalpain蛋白产物主要分布在日本血吸虫尾蚴的头部;Sjcalpain被抑制后可以减少入侵宿主的尾蚴数量,说明Sjcalpain在尾蚴感染宿主皮肤过程中发挥一定的作用。
- 杜晓峰徐斌刘建王吉鹏刘牧刘秀凤马晓琳胡薇鞠川
- 关键词：日本血吸虫尾蚴钙蛋白酶免疫定位侵染
- 日本血吸虫两种酪氨酸酶的克隆、表达和转录特异性分析被引量：1
- 2014年
- 目的克隆、表达日本血吸虫2种酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的全长基因．并研究这2种基因在日本血吸虫不同性别和不同发育阶段的转录特异性。方法设计特异性引物，从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出SjTYR1和SjTYR2的全长片段，并克隆人原核表达载体pSJ2，验证正确的重组质粒转化大肠埃希菌（E．coli）Rosetta Gami细胞，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并用组氨酸标签对表达产物进行亲和层析纯化。将纯化后获得的重组蛋白SjTYR1和SjTYR2分别免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。分别以重组蛋白免疫兔血清和日本血吸虫感染兔血清为一抗，用蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性和免疫反应性；以重组蛋白免疫兔血清为一抗．用Westernblotting观察其与日本血吸虫虫体蛋白的反应情况。制备感染后14、16、18、20、22、24、26和28d雌虫和雄虫的总RNA，利用RT-PCR分析SjTYR1和SjTYR2基因在日本血吸虫不同性别及不同发育时间的转录水平的差异。结果构建了重组原核表达载体SjTYR11/pSJ2和SjTYR2／pSJ2，诱导后获得包涵体形式表达的重组蛋白，相对分子质量（尬）分别为55000和56800，与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白SjTYR1可被日本血吸虫感染兔血清识别，而SjTYR2则不能。rSjTYR1免疫兔血清与虫体蛋白反应后，可见一条约M100000的条带，rSjTYR2免疫兔血清不与虫体蛋白反应。在雄虫体内，2种酪氨酸酶均不转录；在雌虫体内，2种酪氨酸酶在感染后24d内不转录，自24d开始出现激增，之后逐渐提高，感染后28d达到相对最大值。结论构建了SjTYR1和SjTYR2的重组质粒并表达，2种重组蛋白均具有免疫原性和免疫反应性。SjTYR1和SjTYR2在血吸虫雌虫中特异表达，且在感染终宿主后24-28d转录水平升高。
- 李娜娜王吉鹏杜晓峰胡薇
- 关键词：日本血吸虫酪氨酸酶克隆
- 2023年青海省隆宝滩棘球绦虫虫卵污染情况调查
- 2024年
- 目的了解青海省隆宝滩地区棘球绦虫虫卵的环境污染情况,为有针对性地制定棘球蚴病防治措施提供依据。方法2023年3—4月,在青海省玉树市隆宝镇措桑村的养犬户家庭、村内主要街道及野外区域,分别采集犬科动物粪便、动物毛发、水、土壤、草和食物等不同类型的环境样本,利用PCR技术检测样本棘球绦虫虫卵并比较检出率差异。采用ArcGIS软件并结合ASTER GDEM高程数据,制作样本分布高程地图。结果共采集环境样本400份,棘球绦虫虫卵总检出率为13.50%(54/400);其中犬科动物粪便、动物毛发、水、土壤、草、食物的检出率分别为30.43%(42/138)、5.33%(4/75)、15.38%(2/13)、5.26%(6/114)、0(0/37)、0(0/23)。138份犬科动物粪便中,19份野外粪便未能通过PCR鉴定出动物宿主;其余119份样本中,犬、藏狐、赤狐粪便虫卵检出率分别为11.29%(7/62)、48.84%(21/43)、50.00%(7/14),差异有统计学意义(χ^(2)=20.481,P<0.05)。138份犬科动物粪便中,细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫虫卵检出率分别为2.17%(3/138)、18.12%(25/138)和16.67%(23/138),差异有统计学意义(χ^(2)=19.858,P<0.05)。75份动物毛发样本中,犬、牛的毛发检出率分别为6.06%(4/66)、0(0/9),差异无统计学意义(P>0.05)。13份水样本中,野外河流溪水、村内井水和村内积水的虫卵检出率分别为20.00%(2/10)、0(0/2)和0(0/1),差异无统计学意义(P>0.05)。114份土壤样本中,养犬户家庭、村内主要街道和野外土壤虫卵检出率分别为15.00%(3/20)、15.00%(3/20)和0(0/74),差异有统计学意义(P<0.05)。动物毛发、水和土壤样本中检出的虫卵均为细粒棘球绦虫。在虫卵分布方面,检出虫卵的犬科动物粪便高度集中于野外道路附近地域,其他环境检出虫卵的样本无明显集中趋势。结论青海隆宝滩地区环境虫卵污染严重且分布广泛,需继续采取犬(特别是未拴养犬)及野外传染源(狐狸)驱虫等�
- 孙晨清杨诗杰韩帅王旭陈军虎洪炀张颋张仁杰贺耿城马霄赵存哲龚春花王吉鹏周晓农
- 关键词：棘球绦虫棘球蚴病虫卵污染
- 日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究被引量：2
- 2015年
- 目的探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力。方法利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(Sj CTRL)基因(Gen Bank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系。采用整体原位杂交法定位Sj CTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位。利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的Sj CTRL基因转录水平。制备Sj CTRL-ds RNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化。设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至p ET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)后进行原核表达。将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验。同时设对照组。感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率。结果原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道。Sj CTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度。Sj CTRL-ds RNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7%(P<0.05),但未有可观察到的形态学变化。构建了p ET-28a/Sj CTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白。免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4%,减卵率为80.5%。结论初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低Sj CTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数。
- 柴日奕王吉鹏李健张瑞祥李青刘牧辛玥徐斌胡薇
- 关键词：日本血吸虫原位杂交免疫保护
