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结核分枝杆菌毒力基因的筛选策略: 2003年; 结核病已被WHO列为世界三大传染病之一，其病原菌结核分枝杆菌（Mtb）的致病机制仍不十分清楚。由于多耐药Mtb日渐增多，研发新型抗结核药物及疫苗已势在必行，Mtb毒力基因的研究将因此而成为关键热点。近年来建立的结核分枝杆菌毒力基因的筛选策略主要有差异显示PCR法（DDRT-PCR）、消减杂交法（SH）、体内互补技术及标签转座子诱变技术（STM）等，通过这些方法已发现了rpoV、KatG、erp等诸多Mtb毒力基因。这些技术各有利弊，对于它们各自特点的把握及作出相应的改进，将在今后Mtb及其它病原生物毒力基因的研究中发挥重要作用。; 薛利军; 关键词：结核分枝杆菌毒力基因

HCV2a(JFH1)NS5A蛋白在原核和真核细胞中的表达、鉴定及分析被引量：1: 2007年; 目的在原核与真核细胞中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)2a型JFH1(japanese fulminanthepatitis 1)株NS5A蛋白,分析JFH1NS5A蛋白与其它基因型NS5A蛋白间的差异,为进一步研究NS5A蛋白在HCV病毒复制中的作用奠定基础。方法PCR特异扩增JFH1NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1载体中,构建JFH1NS5A的原核和真核重组表达质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。将pET-JFH1NS5A转化大肠杆菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1NS5A转染HEK293T细胞,在原核与真核系统中进行表达,并以SDS-PAGE、荧光显微术和Westernblot方法检测。利用PubMedBLAST软件对JFH1与HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白间的同源性进行了分析。结果酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。SDS-PAGE电泳检测到融合蛋白在原核细胞中的表达,荧光显微镜观察和Westernblot检测到了GFP-JFH1NS5A融合蛋白在HEK293T细胞中表达。BLAST分析显示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分别为57%、60%、68%和74%。结论JFH1NS5A蛋白在原核与真核细胞中表达成功,为研究HCVNS5A在JFH1株病毒高效复制中的作用提供了材料。; 王永智任浩丁惠赵平薛利军潘卫戚中田; 关键词：丙型肝炎病毒 NS5A蛋白

“拉链(zipper)”与“触发(trigger)”——细菌侵袭的分子机制被引量：1: 2006年; 对宿主细胞的侵袭是细胞内菌致病的关键步骤。细菌侵袭过程与Rho、Rac和Cdc42等Rho家族成员介导的肌动蛋白细胞骨架重排有关,涉及“拉链(zipper)”与“触发(trigger)”两种主要机制以及“拉链-触发(zipper-trigger)”双重机制。研究细菌侵袭过程中Rho家族的作用及相应细胞骨架事件,有助于揭示细菌侵袭的分子机制。; 薛利军戚中田; 关键词：细胞骨架

RhoA蛋白对结核杆菌侵袭A549细胞的影响: 2013年; 探讨结核杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)侵袭A549细胞过程中RhoA蛋白功能。构建靶向RhoA基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体si-RhoA,转染A549细胞,36 h后进行MTB黏附和侵袭细胞实验,蛋白印迹法(Western blot)检测RhoA蛋白表达水平,电镜观察细胞超微结构改变,激光共聚焦显微镜观察细胞微丝骨架变化并计算F-actin重排指数,定量PCR法测量细胞黏附和内吞的MTB数量。结果显示,si-RhoA转染A549细胞后,RhoA蛋白表达下降84.7%,细胞对MTB的黏附能力未改变。MTB侵袭细胞实验显示,si-RhoA转染组细胞F-actin重排指数和内吞细菌数量分别是(63.0±3.1)%和(3.19±0.26)×103拷贝,无关siRNA组分别是(84.5±1.8)%和(4.45±0.29)×103拷贝,前者均少于后者(P<0.01)。由此可见,结核杆菌侵袭A549细胞需要RhoA蛋白参与,可能通过"拉链"机制介导结核杆菌侵袭非吞噬细胞。; 邵圣文周洪昌徐伯赢张慧薛利军; 关键词：结核杆菌 RHOA基因 A549细胞

基于16S rDNAs的快速检测血液细菌污染的荧光定量PCR研究被引量：4: 2007年; 目的探讨快速筛选血液及血液制品中细菌污染的方法。方法对20余种常见致病性细菌的16SrDNAs进行多序列比对,设计扩增细菌16SrDNAs基因的荧光定量PCR(FQ-PCR)通用引物。以12种致病菌、2种真菌、1种支原体、1种病毒和人基因组DNA为模板,验证通用引物检测细菌的特异性。通用引物扩增金黄色葡萄球菌16SrDNA靶片段,构建标准质粒pMDT-Bfr,并建立FQ-PCR定量标准曲线。分别以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作为革兰阳性和革兰阴性细菌代表菌,以其不同浓度的DNA为模板进行FQ-PCR反应,检验该方法的敏感性。抽提梯度稀释的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌模拟血液细菌污染标本的总DNA作为FQ-PCR反应模板,检验基于16SrDNAs的FQ-PCR作为血液细菌污染检测方法的敏感性。结果设计的FQ-PCR通用引物有较高的特异性,仅能检测出细菌的16SrDNAs;用该方法检测革兰阳性和革兰阴性菌,对于浓度在103拷贝/μl以上的16SrDNAs基因都可以准确定量;以该方法检测血液细菌污染模拟标本,灵敏度可达到105CFU/ml。结论初步建立了以16SrDNAs作为FQ-PCR靶基因快速检测血液细菌污染的方法。该方法特异性强、灵敏度高、成本低廉,具有很好的研究价值与应用前景。; 王永智薛利军任浩赵平朱诗应李冕戚中田; 关键词：细菌污染荧光定量PCR

靶向CDC42基因小干扰RNA分子的制备: 2011年; 目的制备靶向CDC42基因的小干扰RNA分子(siRNA)并检测其对CDC42基因表达的抑制效果。方法针对CDC42基因的不同区域设计4条siRNA分子,体外转录法合成siRNA分子,将siRNA与CDC42基因真核表达载体共转染HEK293T细胞,Westernblot法测定CDC42蛋白含量。结果合成了siR1、siR2、siR3、siR4共4条siRNA分子,siR3对CDC42基因表达的抑制率为95%,siR1、siR2以及siR4对CDC42基因表达的抑制作用不明显。siR3对HEK293T细胞生长无明显影响。结论体外转录法制备的siR3分子能够高效特异地抑制CDC42基因表达。; 邵圣文薛利军周洪昌段劲王洁卢添宝徐菊玲; 关键词：小干扰RNA 体外转录

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立被引量：5: 2011年; 目的探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价。方法针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculo-sis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR(FQ-PCR)反应体系;提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本;以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV)。结果靶向Mtb 16SrDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA)1.2 pg/μL,即(38.9±3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27%和1.26%。结论以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测。; 徐菊玲徐伯赢周洪昌张慧段劲薛利军邵圣文; 关键词：结核杆菌 RDNA 荧光定量PCR

16S rDNA用作荧光定量PCR靶基因快速检测铜绿假单胞菌被引量：11: 2006年; 对20余种细菌16SrDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)特异性引物。提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16SrDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr。将梯度稀释的pMDT-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线。以SYBRGreenI荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PADNA样品进行FQ-PCR检测。同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性。结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16SrDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言,以16SrDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景。; 薛利军王永智任浩童一民赵平朱诗应戚中田; 关键词：铜绿假单胞菌 RDNA 荧光定量PCR

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