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猪轮状病毒NJ2012株VP8基因序列分析及原核表达被引量：3: 2020年; 为深入研究猪轮状病毒VP8蛋白的结构和功能,以及研制新型猪轮状病毒疫苗,利用生物信息学软件DNAStar对本研究室保存的1株A组G9P7型猪轮状病毒NJ2012的VP8基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法扩增VP8蛋白编码基因,用限制性核酸内切酶对目的片段与pET28a(+)原核表达载体进行双酶切,构建了重组原核表达载体,用IPTG诱导表达,并进行Western blot验证。结果显示:NJ2012毒株的VP8基因序列与参考毒株序列的核苷酸同源性为53.9%~99.2%,氨基酸同源性为42.1%~97.5%;VP8基因克隆成功,经测序与目的基因完全一致;经鉴定,构建的重组原核表达质粒pET28a-VP8能够在DE3宿主菌中表达,该蛋白以包涵体形式存在;Western blot结果显示该蛋白可与抗His-tag鼠单克隆抗体发生特异性反应。本研究实现了VP8蛋白在原核系统中稳定表达,为调查该蛋白的免疫原性及研制安全、高效的猪轮状病毒亚单位疫苗提供了参考。; 常新见周金柱范宝超郭容利朱琳赵永祥牛家强何孔旺李彬; 关键词：猪轮状病毒蛋白纯化原核表达

猪IFN-δ5的表达纯化及其抗PEDV感染的作用分析: 2022年; 【目的】试验旨在建立大量表达及纯化猪δ5干扰素(pIFN-δ5)的方法,并对其抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染的作用进行分析。【方法】根据GenBank中pIFN-δ5序列(登录号:NM_001164854.1)设计引物,以猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增;将目的基因连接入经EcoRⅤ和HindⅢ双酶切的线性化pET-32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化诱导表达条件,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;pIFN-δ5蛋白大量表达后使用镍离子亲和层析柱纯化,并测定蛋白纯度;采用细胞病变抑制法检测pIFN-δ5的干扰素效价,采用CCK8方法检测pIFN-δ5的细胞毒性,进一步测定其抗PEDV的感染能力。【结果】试验成功构建了重组表达质粒pET-pIFNδ5,经诱导条件摸索发现,在D值为0.5~0.6、IPTG浓度为0.8 mmol/L、37℃诱导条件下,目的蛋白pIFN-δ5主要表达于菌体裂解上清中;经大量表达并纯化后可获得纯度>95%的pIFN-δ5蛋白。使用VSV/MDCK细胞滴定系统检测pIFN-δ5的比活性为5×10^(4)U/mg;CCK8检测表明pIFN-δ5的细胞毒性较小。实时荧光定量PCR、Western blotting和间接免疫荧光检测结果表明,pIFN-δ5具有显著抗PEDV感染能力。【结论】本试验建立了表达和纯化pIFN-δ5的方法,通过一系列的体外抗病毒试验证实pIFN-δ5具有良好的抗PEDV感染的活性,为将pIFN-δ5作为抗病毒药物及临床应用奠定了基础。; 宋诗莹郭玮璐夏学峰张雪毕振威张雪寒范宝超董海龙李彬; 关键词：抗病毒活性

2017—2019年华东地区猪场主要病毒性腹泻病原调查被引量：22: 2020年; 本研究旨在了解当前我国华东地区引起猪腹泻的主要病毒性腹泻病原的流行情况,为该地区更好地开展猪腹泻病毒的防控工作提供临床数据。分别采用RT-PCR检测方法对2017—2019年华东地区35个场别594份临床样品检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪萨佩罗病毒(porcine Sapelovirus,PSV)等5种猪的病毒性腹泻病原,并对其阳性率及混合感染情况进行统计分析。结果显示,2017—2019年的PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV及PSV的平均阳性率为分别为62.6%(372/594)、27.9%(166/594)、16.8%(100/594)、13.3%(79/594)及3.87%(23/594),二重混合感染中以PEDV+PDCoV及PEDV+PoRV为主,平均混合感染率分别为22.4%(133/594)和13.3%(79/594)。三重感染中以PEDV+PoRV+PDCoV混合感染为主,感染率为7.58%(45/594),未见四重及五重病原混合感染。2017—2019年PEDV平均阳性检出率最高,且常与PoRV及PDCoV发生混合感染,是当前华东地区猪病毒性腹泻类疫病的防控重点。TGEV和PDCoV在健康育肥猪及母猪的检出率中占比较大,表明隐性感染变得普遍,值得养殖户关注。除此之外,PSV的检出率远低于其他4种腹泻病毒。总之,随着2018年后养殖场加强生物安全防控措施和猪群管理,各病原检出率和阳性场检出率呈现逐年下降趋势。; 常新见周金柱殷杰牛贝贝范宝超郭容利赵永祥牛家强何孔旺李彬; 关键词：猪病毒性腹泻 PEDV

猪δ冠状病毒M基因RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：19: 2016年; 猪δ冠状病毒（PDCo V）是2014年在美国最新检测出的一种猪源冠状病毒。为评估PDCo V在我国的感染和流行情况,根据Gen Bank中登陆的PDCo V M基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,建立了一种基于M基因的猪δ冠状病毒RT-PCR检测方法。研究结果表明,该方法特异性较好,仅对PDCo V有特异性的扩增,对其它主要猪病病毒核酸扩增均呈阴性;敏感性较高,最低检测限可达6.33×104拷贝/μL。运用该方法对我国华东地区猪场2014-2015年间的492份临床样品进行检测结果显示,PDCo V总阳性率为2.85%（14/492）,其中腹泻样品中阳性率为18.60%（8/43）,表明本研究建立的RT-PCR方法可以对临床样品进行有效检测。; 逄凤娇张柏猛何孔旺俞正玉徐向伟郭容利范宝超温立斌李彬姜平; 关键词：RT-PCR

猪流行性腹泻病毒M和S蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：3: 2014年; 采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。表达产物经SDS-PAGE后切胶免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Westernblot和间接免疫荧光方法检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLP)抗原和建立血清学检测方法奠定基础。; 郑芳园陈攀范宝超李玉峰; 关键词：猪流行性腹泻病毒 M蛋白 S蛋白原核表达多克隆抗体

猪流行性腹泻病毒流行株AH2012/12的分离及感染性克隆的构建: 2010年以来,猪流行性腹泻(PED)疫情大规模的再次爆发,对世界多个国家造成了重大的经济损失,并确定该疫情的病原体为猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株。尽管市场上具有可用的商品化PEDV疫苗,但连续地PED的流行表明现...; 范宝超俞正玉逢凤娇徐向伟张柏猛郭容利李彬何孔旺

一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用: 本发明提供一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用，涉及生物技术领域。用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID N...; 肖琦何孔旺茅爱华汪伟俞正玉郭佳慧温立斌胡屹屹朱雪蛟李彬郭容利范宝超周萍曲梦倪艳秀周俊明祝昊丹王丹丹张雪寒张碧成吕立新沈江萍; 文献传递

PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用: 本发明提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用，属于分子生物学和病毒学领域。构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模...; 范宝超李彬何孔旺焦点郭容利俞正玉朱琳; 文献传递

猪肠道病毒甲型3C基因的克隆和原核蛋白的表达被引量：3: 2017年; 猪肠道病毒甲型(PEV A)是一种无囊膜、球形的单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科,能引起猪脑脊髓灰质炎、肠道、呼吸道、生殖器官疾病等多系统综合征。本试验采用基于PAS(PCR-based accurate synthesis)的方法,设计全长拼接引物,在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因PEV A 3C,连入表达载体pCzn1;获得的重组质粒pCzn1-PEV A 3C转入Arctic Express表达菌株。诱导表达目的蛋白PEV A 3C,通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。结果表明,成功构建了原核表达菌株,其所表达的融合蛋白分子质量约为21.7 ku,为下一步PEV A特异性ELISA检测方法的建立奠定了基础。; 孙杰朱琳焦点俞正玉范宝超袁万哲王建辉郭容利何孔旺李彬; 关键词：蛋白表达

重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物: 本发明提供一种重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物。重组蛋白是由来自猪流行性腹泻病毒S蛋白(Spike，纤突蛋白)的截短片段与猪IgG的Fc片段串联而成的融合蛋白，S蛋白的截短片段优选选自S蛋白的S1亚基中具有唾液酸结合活性...; 李彬范宝超时丹怡周金柱郭容利何孔旺赵永祥朱雪蛟李澧汪伟王丹丹祝昊丹; 文献传递

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范宝超

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