刁志宏
- 作品数：13 被引量：20H指数：3
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- 重组乙型肝炎病毒P22^e基因在HepG2细胞中的表达被引量：5
- 2006年
- 目的:利用pCDNA3.1+真核表达载体,建立了稳定表达乙型肝炎(HBV)P22e的HepG2细胞系,用以研究HBVP22e与乙型肝炎发病机制的关系.方法:以含1.2copiesHBV基因(adr亚型)p3.8II质粒为模板,PCR获得HBVP22ecDNA片段,分离插入通用T载体pMD18T中鉴定,然后装入真核表达型载体pCDNA3.1+中,脂质体转染HepG2细胞株,免疫组化鉴定细胞内表达,微粒子免疫检查培养上清中分泌抗原.结果:成功构建了真核表达载体pCDNA3.1+HBVP22e,并转染HepG2细胞,经多次传代培养鉴定,获得稳定表达HBVP22e的HepG2细胞系.结论:HBVP22e可在HepG2中表达.
- 刁志宏张明霞朱幼芙何海棠王战会陈金军侯金林
- 关键词：基因重组真核表达
- 定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达被引量：1
- 2006年
- 目的:构建携带V60,G87,L97突变位点的HBV全基因组真核细胞表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCL),建立相同HLA背景下的慢性HBV感染CTL应答的刺激细胞和靶细胞.方法:用定点突变技术在HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60,G87,L97位置进行突变(p3.8Ⅱ-V60,G87,L97),转化E.coliXL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBO-plpp真核细胞表达载体,转染LCL,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞是能够稳定表达.结果:DNA序列分析表明,野型HBVDNA核心区第60,87,97位氨基酸发生了预期的突变,WesternBlot和微粒子免疫荧光法证明,转染的LCL能稳定表达HBV抗原.结论:定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中可稳定表达.
- 张明霞刁志宏侯金林骆抗先
- 关键词：真核细胞表达载体B淋巴母细胞系
- CpG基序联合EB病毒建立永生化B淋巴母细胞系被引量：1
- 2007年
- 目的体外建立慢性乙型肝炎患者永生化的B淋巴母细胞系(LCLs)。方法用EB病毒感染自慢性乙型肝炎患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19和CD23的表达水平。结果46例患者PBMC经EBV感染4周后,42例转化成永生化B淋巴母细胞系,成功率为91.3%。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。结论CpG免疫调节基序联合EBV感染人PBMC,提高转化效率,转化后的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。
- 张明霞刁志宏侯金林骆抗先
- 关键词：乙型肝炎病毒EB病毒B淋巴母细胞系
- HBV全基因C区突变株在永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达被引量：2
- 2006年
- 目的构建携带V60、G87和L97突变位点的HBV全基因组真核表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCLs)。方法用定点突变技术将HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60、G87、L97进行突变(p3.8Ⅱ-V60,G87,L97),转化E.coli.XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBV-plpp真核细胞表达载体,转染LCLs,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞能够稳定表达。结果与结论DNA序列分析表明,野型HBVDNA核心区第60、87、97位氨基酸发生了预期的突变,WesternBlotting和微粒子免疫荧光法证明转染的LCLs能稳定表达HBV抗原,证实成功构建了预期细胞模型。
- 张明霞周福元刁志宏何海棠侯金林骆抗先
- 关键词：乙型肝炎病毒真核细胞表达载体
- 慢性乙型肝炎患者血清中HBV-DNA与HBeAg含量关系的研究
- 目的探讨慢性乙型肝炎患者血清中HBeAg含量与HBV-DNA含量的关系。方法测定58例慢性乙型肝炎患者血HBV-DNA含量采用定量荧光PCR技术。采用微粒子捕捉免疫发光技术测定HBeAg。结果血清HBeAg阳性组HBV-...
- 刁志宏周问渠杨永泉李秋生李薇徐德兴
- 文献传递
- EGFP-HBVP22e融合蛋白在HepG2中的表达
- 目的:利用pEGFP-C2真核表达载体,建立了稳定表达乙型肝炎病毒(HBV)P22e的HepG2细胞系,用以研究HBVP22e与乙型肝炎发病机制的关系。方法:以含1．2copiesHBV基因(adr亚型)p3．8Ⅱ质粒为...
- 刁志宏张明霞朱幼芙何海棠王战会陈金军侯金林
- 文献传递
- EGFP-HBVP22^e融合蛋白在HepG2中的表达被引量：3
- 2007年
- 目的利用pEGFP-C2真核表达载体,建立稳定表达乙型肝炎病毒(HBV)P22e的HepG2细胞系。方法以含1.2拷贝HBV基因(adr亚型)的p3.8Ⅱ质粒为模板,PCR获得HBVP22ecDNA片段,分离插入通用T载体pMD18-T中鉴定,然后装入真核表达型载体pEGFP-C2中,HBVP22e与EGFP基因融合,脂质体转染HepG2细胞株,荧光显微镜下观察EGFP-HBVP22e融合蛋白的胞内表达,Westernblot检测阳性克隆细胞EGFP-HBVP22e的表达。结果成功构建了真核表达载体pEGFP-C2HBVP22e,并转染HepG2细胞,经多次传代培养鉴定,获得稳定表达EGFP-HBVP22e融合蛋白的HepG2细胞系。结论该细胞系的建立为进一步研究HBVP22e的生物学功能与乙型肝炎发病机制的关系奠定了基础。
- 刁志宏张明霞朱幼芙何海棠王战会侯金林
- 关键词：肝炎病毒乙型基因重组真核表达
- 乙型肝炎病毒P22^e蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响被引量：3
- 2007年
- 目的研究乙型肝炎病毒P22e蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响。方法利用含HBVP22e基因的重组pEGFP-C2HBVP22e质粒的人肝细胞癌细胞系HepG2,并以Act-D、TNFα诱导该细胞系发生凋亡,使用流式细胞术,检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例代表凋亡细胞数;使用激光共聚焦显微镜,观察凋亡细胞核的变化,进一步研究HBVP22e在肝细胞凋亡的生物学功能效应。结果HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞系在发生凋亡的时间上比HepG2细胞系有明显延迟,凋亡的发生率也明显低于HepG2细胞系(P<0.01)。结论由于外源性基因HBVP22e的引入及表达,对HepG2细胞的凋亡有明显的抑制作用。
- 刁志宏张明霞朱幼芙侯金林
- 关键词：凋亡肿瘤坏死因子Α流式细胞术激光共聚焦显微镜
- 乙型肝炎病毒／P22蛋白对HepG2细胞凋亡的影响被引量：1
- 2008年
- 目的研究HBV／P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的HepG2细胞凋亡的影响。方法用放线菌素D和TNFo【分别诱导表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞（实验组）、表达空载体的HepG2细胞（阴性对照组）和HepG2细胞（空白对照组）凋亡，雅培试剂检测细胞上清液中HBeAg的表达，Westernblot及免疫细胞化学法检测HBV／P22蛋白表达，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。体内实验：将前述三种细胞分别注射入裸鼠皮下，放线菌素D、TNF仅注射瘤体后，免疫组织化学法检测组织HBV／P22蛋白的表达，TUNEL法检测组织细胞凋亡率。结果实验组细胞培养上清液中HBeAg表达阳性，两对照组阴性；Westernblot及免疫细胞化学法检测均显示实验组细胞有HBV／P22蛋白表达，两对照组均为阴性；流式细胞仪和TUNEL结果均显示实验组细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。体内实验：实验组瘤体组织免疫组织化学检测结果显示HBV／P22蛋白表达阳性，TUNEL检测结果显示接种表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞裸鼠瘤组织细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。结论HBV／P22蛋白在体内外均可抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。
- 张帆刁志宏余治健张明霞朱幼芙
- 关键词：肝细胞细胞凋亡
- 乙型肝炎病毒P22^e蛋白经核因子-κB抑制HepG2细胞凋亡
- 2009年
- 目的探讨核因子-κB（NF-κB）在乙型肝炎病毒P22。蛋白抑制HepG2细胞凋亡中的作用。方法用含HBVP22。基因的重组pEGFP-C2HBVP22。质粒的肝癌细胞HepG2，以放线菌素-D（ActD）、肿瘤坏死因子（TNF）α诱导该细胞凋亡，采用激光共聚焦显微镜、核蛋白电泳迁移率等技术，观察在HBVP22e抑制TNFα诱导HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞的凋亡过程中NF-κB的核转移、活化等情况。用NF-κB抑制剂ALLN抑制其信号通路，检测以Act-D、TNFα诱导的HepG2、HepG2EGFP—C2HBVP22。细胞凋亡率的变化。对实验结果的数据分析用秩和检验和t检验。结果激光共聚焦显微镜及电泳迁移率实验观察到HepG2EGFP—C2HBVP22。细胞在发生凋亡前后，有明显的NF—KB向核内迁移活化现象。NF-κB抑制剂ALLN可使以Act-D、TNF仅诱导HepG2EGFP—C2HBVP22^e细胞的凋亡率明显升高（6．19％±1．58％与39．99％±7．62％，t=7．515，JD〈0．01）。结论在HBVP22。蛋白抑制肝癌细胞凋亡过程中，NF-κB信号途径起着重要作用。
- 刁志宏张明霞朱幼芙石玉玲侯金林
- 关键词：细胞凋亡NF-ΚB
