温州医学院检验医学院微生态学研究所
- 作品数：11 被引量：51H指数：5
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- SHV-4型ESBL在pET26b/BL(DE3)中的表达纯化及其特性研究被引量：3
- 2007年
- 目的:表达SHV-4型超广谱β-内酰胺酶,对纯化的SHV-4酶进行特性研究。方法:将SHV-4基因克隆到pET26b表达质粒,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)构建工程菌,重组工程菌经摇瓶发酵后获得种子菌,种子菌转入发酵罐发酵,当菌体密度OD600为0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L,于37℃培养6h。培养液离心收获菌体沉淀,其超声裂解上清液进行Ni2+亲和层析,获取的SHV-4酶进行分子量、纯度、等电点、最适条件、米氏常数、催化常数等特性进行分析。结果:SDS-PAGE电泳,等电聚焦电泳及系列的酶动力学实验表明SHV-4酶分子量约为30kD,纯度大于95%,等电点为7.9,最适pH值为6.0～8.0,最适温度为37℃,以头孢硝噻吩为底物测定的Km值为2.61×10-6mol/L,Kcat为258s,Kcat/Km为9.88×107mol-1·s-1·vL。结论:重组的SHV-4酶初步满足制成商品酶的条件。
- 王震叶明君邹立林季敬璋陈秀枢吕建新
- 关键词：超广谱Β-内酰胺酶纯化
- 超广谱和耐酶抑制剂β-内酰胺酶的研究进展被引量：13
- 2005年
- 产超广谱和耐酶抑制剂 β -内酰胺酶是革兰阴性菌对 β -内酰胺类抗生素耐药的重要原因。近几十年 ,这些酶的种类迅速增加 ,掌握它们的分类、构效关系和耐药模式等方面的知识 ,对临床合理使用抗生素和防止耐药菌的产生具有重要意义。对超广谱和耐酶抑制剂 β -内酰胺酶的最新分类 ,它们水解 β -内酰胺类抗生素的主要结构特点 ,及其氨基酸位点突变对构效关系的影响进行了介绍。
- 王震吕建新陈秀枢
- 关键词：Β-内酰胺酶酶抑制剂Β-内酰胺类抗生素广谱构效关系位点突变
- TEM-116型ESBL天然酶与重组酶的动力学特性研究被引量：5
- 2007年
- 目的研究TEM-116型ESBL天然酶与重组酶的动力学特性,并比较它们的差异。方法采用紫外分光光度法检测酶促抗生素水解反应,以Lee-Wilson改良双倒数方程数据处理法进行数据处理,测定天然酶与重组酶的Km、Vmax及kcat。观察温度和pH对酶促反应的影响。结果以Lee-Wilson改良双倒数方程数据处理法进行数据处理方便而准确地测定了天然酶与重组酶的Km与Vmax并计算出kcat。温度和pH对天然酶与重组酶酶促反应效应相似。天然酶与重组酶最优先的底物均为头孢哌酮,其次是头孢氨苄;对氨苄西林、阿莫西林、青霉素和哌拉西林有最高的催化效率。结论天然酶与重组酶的动力学参数无显著差异。
- 曾贤铭陈秀枢王震吕建新楼永良孙长贵陆永绥
- 关键词：动力学Β-内酰胺酶重组蛋白Β-内酰胺类抗生素
- 问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定
- 2009年
- 目的了解我国15群15株问号钩端螺旋体（简称问号钩体）参考标准株携带ompA基因情况，重组表达OmpA（rOmpA）并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性。方法采用酚．氯仿法提取问号钩体基因组DNA，PCR扩增全长ompA基因，T—A克隆后测序。构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统，采用SDS—PAGE及Bio—Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量。rOmpA免疫家兔以获得抗血清，采用免疫扩散试验检测抗血清效价。采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性，显微镜凝集试验（MAT）检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况。分别采用问号钩体黏附J774A．1细胞模型和豚鼠感染模型，了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用。结果15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因，双曲钩体Patoc Ⅰ株则否。rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20％。rOmpA能诱导家兔产生抗体，其抗血清免疫扩散效价为1：4。兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号。rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1：20～1：320。1：10～1：160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A．1细胞，100μg和200μgrOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50．0％和75．0％。结论ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中。rOmpA具有较好的抗原性，多种免疫学方法检测显示，有可能作为通用型问号钩体基因工程疫苗的候选抗原。
- 丁威董海艳薛峰严杰楼永良
- 关键词：问号钩端螺旋体免疫原性免疫保护性
- TEM-116型超广谱β-内酰胺酶对牛奶中抗生素的清除被引量：14
- 2008年
- 目的利用TEM-116型超广谱β-内酰胺酶能降解具有β-内酰胺环的抗生素的特性清除牛奶中的此类抗生素。方法DelvotestSP试剂盒检测三个温度条件下所需的TEM-116型酶的剂量。结果37℃,反应0.5h,1.032IU/L的TEM-116型酶能把牛奶中青霉素G清除;23℃,0.5h,1.29IU/L的TEM-116酶能把牛奶中的青霉素G清除;4℃,8～12h,O.22IU/L的TEM-116酶能清除牛奶中的青霉素G。结论TEM-116型超广谱β-内酰胺酶在不苛刻的条件下很容易清除牛奶中残留的青霉素G。
- 郑颖王震范泉水邱薇陈秀枢李江
- 关键词：超广谱Β-内酰胺酶牛奶青霉素G
- 壳聚糖微球固定化重组TEM-116型ESBL的研究被引量：2
- 2011年
- 目的利用固定化酶技术,使重组TEM-116型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)在清除环境中残留抗生素的应用中可重复使用,并改善其稳定性。方法以戊二醛为交联剂将重组TEM-116型ESBL固定于壳聚糖微球载体,并采用单因素轮换法和响应曲面法对固定化条件进行优化。结果 4℃条件下,当戊二醛浓度0.54%、交联pH5.4、给酶量0.58IU/g壳聚糖微球、固定化pH6.2时,固定化酶的酶活和回收率分别可达到0.49IU/g和84%(0.49IU/0.58IU)。与游离酶相比,固定化酶的酸碱稳定性和可重复利用性得到显著提高,在pH5.8～7.4范围内酶活性保持在73%～100%的水平,经7次重复性使用,每次1h,酶活力保留高达80%。结论通过固定化酶技术,以重组TEM-116型ESBL为代表的耐药酶能够开发为具有广泛应用前景的环保制剂,以消除外环境中残留的抗生素。
- 徐荣韩冬青王震楼永良陈秀枢
- 关键词：壳聚糖固定化酶超广谱Β-内酰胺酶
- 超广谱Β内酰胺酶SHV-4型基因克隆表达与纯化研究
- 2006年
- 楼永良王震郑颖吕建新陈秀枢尹惠琼邱薇李作生范泉水高国辉陆永绥
- 关键词：超广谱Β内酰胺酶基因克隆表达微生物学诊断食品监测药物生产耐药菌
- 创伤弧菌溶细胞素基因重组蛋白复性条件的优化及溶血活性鉴定被引量：6
- 2007年
- 目的:对由大肠杆菌表达系统表达的创伤弧菌溶细胞素蛋白包涵体的复性条件进行优化并对其溶血活性进行评价。方法:表达、提取并纯化重组蛋白,并对其包涵体利用PBS透析复性、16种不同复性液透析复性和柱上复性方法进行复性比较,复性蛋白用溶血试验验证其活性。结果:利用三种蛋白复性方法,重组蛋白均不同程度得到复性,其中复性液中盐酸胍、助溶剂及盐离子作用显著。柱上复性效果明显,其复性率高达98%。利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU。结论:成功对重组蛋白包涵体复性条件进行优化,并对复性后蛋白质的溶血活性进行鉴定,为今后的免疫学活性和变性蛋白质复性研究奠定了基础。
- 李桂军谢旦立楼永良
- 关键词：创伤弧菌溶细胞素溶血活性
- 创伤弧菌溶细胞素抗原表位预测及其噬菌体展示肽的构建
- 2008年
- 目的预测创伤弧菌溶细胞素(vibrio vulnificus cytolysin)的抗原表位,为研制多抗原肽疫苗(MAP)奠定基础。方法采用生物信息学技术对Vvc的T细胞和B细胞表位进行预测及分析。选取Vvc主要T细胞和B细胞联合表位肽构建噬菌体展示系统。PEG/NaCl沉淀法提纯重组噬菌体,SDS-PAGE鉴定目的重组PIII蛋白(rPIII)。Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白rVvc常规皮下免疫法制备兔抗血清。rVvc抗血清为一抗,采用Western blot对上述表位肽进行鉴定和筛选。结果预测的4个主要表位肽Vvha1、Vvah2、Vvha3和Vvha4在M13噬菌体中获得成功表达。采用rVvc抗血清为一抗,Western blot对上述表位肽进行鉴定和筛选:Vvha2、Vvha4反应强度高于Vvha1和Vvha3。结论本实验成功地构建Vvc主要T细胞和B细胞联合表位肽噬菌体展示系统。
- 肖美英楼永良严杰
- 关键词：创伤弧菌噬菌体展示B细胞表位T细胞表位
- 创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定被引量：11
- 2007年
- 目的用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,并对其溶血活性进行评价。为今后的免疫学活性研究和单克隆检测试剂盒的研发奠定基础。方法构建pET28a(+)-vvhA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲合层析(HisTag)纯化重组蛋白,并用溶血试验验证重组蛋白活性。结果用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)重组蛋白VVC。利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU。结论成功用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素并对其纯化、复性条件进行优化。
- 李桂军楼永良严杰
- 关键词：创伤弧菌溶细胞素溶血活性
