江苏省自然科学基金(BK2007058)
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
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- IRES/polyA-promoter介导的Ang-1与VEGF165双基因表达效率的对比分析被引量：2
- 2010年
- 目的：构建IRES及polyA-promoter介导人血管生成素-1（Angiogenin-1,Ang-1）和人血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor165,VEGF165）双基因共表达的腺病毒载体,比较IRES与polyA-promoter不同表达模式及其对位于二者前后基因的表达效率和诱导兔角膜新生血管的形成功能,为今后构建双基因或多基因高效共表达载体提供实验依据。方法：以pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒为模板,PCR扩增人VEGF165及Ang-1基因片段,分别将其亚克隆至改建的pAdTrack-CMV-PolyA-promoter及pAdTrack-CMV-IRES转移质粒中,构建pTrack-CMV-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、pTrack-CMV-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1、pTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1基因重组转移质粒,再与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中同源重组,然后经PacI线性化后转染QBI-293A人胚肾成纤维细胞（简称293A细胞）,收获腺病毒重组病毒子Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165及Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165在QBI-293A细胞中的转录,ELISA法分别检测不同腺病毒载体目的基因的表达量,比较分析Ang-1与VEGF165基因在IRES和polyA-promoter介导的不同腺病毒表达载体中的表达能力,及在同一腺病毒表达载体中前后不同位置的表达效率。并进一步于兔角膜缘注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165,Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,Ad-Ang-1-IRES-VEGF165,检测角膜新生血管的面积,并比较其诱导血管形成能力的差异。结果：测序显示Ang-1和VEGF165序列正确,不同重组腺病毒载体均获得成功包装,病毒效价可达2~5×1010pfu/m l,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165均能有效转录,ELISA法检测结果表明Ang-1、VEGF165基因不仅均能在细胞中有效表达,而且IRES介导的Ang-1及VEGF165基因,无论在IRES上游或下游,其表达量均低于polyA-promoter相同位置的Ang-1及VEGF165基因表达量,大约降低60%~70%左右,同时Ang-1/VEGF165在同一载体上、下�
- 陈瑶缪竞诚韩亚丽盛伟华包婉蓉田丽娜张凤娟吕海涛杨吉成
- 关键词：血管生成素-1血管内皮生长因子IRES
- 血管内皮祖细胞用于构建血管新生的体外三维模型被引量：2
- 2009年
- 目的采用血管内皮祖细胞(EPCs)体外构建血管新生的三维模型,证实体外获得的EPCs参与血管新生。方法(1)密度梯度离心法获取兔外周静脉血的单个核细胞,贴壁筛选法分离EPCs,于添加了Singlequotes的EBM-2培养液中扩增,对培养14 d的细胞进行免疫荧光及免疫组织化学鉴定;(2)用上述同样的方法获取EPCs,并接种于Matrigel三维基底膜胶,Singlequotes诱导,倒置相差显微镜观察血管形成。结果(1)培养7～9 d,光电显微镜可见细胞集落形成,呈现干细胞特性;贴壁细胞表达血管性假血友病因子(v WF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin),呈现内皮细胞系特征;贴壁细胞用碳化青染料(DIL)标记的乙酰化低密度脂蛋白(DIL-ac-LDL)及FITC标记的I型荆豆凝集素(FITC-UEA-1)双荧光阳性,显现EPCs的生物学特性;(2)动态观察:培养2周左右,在三维胶体中形成血管结构。结论外周血来源的EPCs,经过体外诱导后,具有成血管能力,可应用于制备体外血管新生的三维模型。
- 吕海涛韩莲花程铖李红霞周亚锋杨向军
- 关键词：内皮祖细胞血管新生三维模型
- 血管生成素1基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用
- 2011年
- 目的 构建携带人血管生成素1（Ang-1）基因的腺病毒表达载体，并观察其感染QBI-293A靶细胞后目的基因的表达及其促血管新生的效应。方法 以骨髓细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增Ang-1基因片段，于BglⅡ、Sal Ⅰ酶切位点亚克隆至pAdTrack-CMV，构建pAdTrack-CMV-Ang-1重组转移质粒。然后pAdTrack-CMV-Ang-1重组转移质粒与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒同源重组后，再经QBI-293A细胞包装、扩增和纯化获得高滴度的Ad-Ang-1重组腺病毒。RT-PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性Ang-1基因在QBI-293A细胞中的转录和表达。将鸡胚随机分成3组：Ad-Ang-1重组腺病毒组、Ad空载体腺病毒组、生理盐水（NS）组，观察鸡胚绒毛膜尿囊膜（CAM）新生血管形成。结果获得了高滴度的Ad-Ang-1重组腺病毒，其病毒效价可达3×1010 pfu/ml。Ad-Ang-1感染后，QBI-293A细胞中的Ang-1含量（47522.53±3685.57） ng/L较QBI-293A细胞对照组（2490.86±550.95） ng/L和Ad空病毒感染组（2323.20±260.55） ng/L均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。Ad-Ang-1重组腺病毒组有效地促进了二、三级分支血管的生成。结论 成功获得了携带人Ang-1基因的腺病毒表达载体，为进一步开展Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。
- 孙凌谢宇锋杨吉成杨向军盛伟华贾红亮吕海涛
- 关键词：血管生成素1腺病毒基因载体血管形成
- 血管生成素-1基因重组腺病毒转染兔外周血血管内皮祖细胞的研究被引量：1
- 2011年
- 目的探讨重组腺病毒介导的血管生成素-1(Ang-1)基因转染兔外周血血管内皮祖细胞(EPCs)的方法及效果。方法从兔外周血中体外分离、扩增EPCs,采用免疫组织化学和荧光化学法鉴定EPCs,设EPCs细胞对照组(EPCs)、EPCs+Ad空病毒载体对照组(EPCs+Ad)及EPCs+Ad-Ang-1组(EPCs+Ad-Ang-1)。以携带Ang-1基因的重组腺病毒转染EPCs后,用荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR鉴定细胞内Ang-1基因在EPCs中的转录;ELISA法检测细胞培养上清中的Ang-1蛋白表达。结果 EPCs+Ad-Ang-1组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光;RT-PCR鉴定证实EPCs细胞内的Ang-1转录;ELISA检测证实EPCs+Ad-Ang-1组细胞上清液中Ang-1的浓度高于EPCs组和EPCs+Ad组(均P<0.05)。结论腺病毒介导的Ang-1基因转染外周血EPCs可行。
- 朱伯会谢宇锋杨向军杨吉成韩莲花李红霞盛伟华孙凌吕海涛
- 关键词：基因转染内皮祖细胞
