国家自然科学基金(81100747)
- 作品数：7 被引量：11H指数：2
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- 嗜酸乳杆菌GGDEF和EAL结构域相关蛋白的表达、纯化及活性分析被引量：2
- 2017年
- 目的鉴定嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中含GGDEF和EAL结构域相关蛋白的功能。为进一步研究环二鸟苷酸(c-di-GMP)在该菌株中的调控机制奠定基础。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组中PCR扩增出NH13_07045-GGDEF、NH13_07050和NH13_07055这3个基因片段,分别构建其重组表达质粒。经鉴定后,转入大肠杆菌表达宿主中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经直链淀粉树脂纯化后进行体外酶活性实验,再通过高效液相色谱检测反应产物。结果通过PCR扩增的目的基因片段经重组质粒双酶切后其大小与预期相符,测序结果与Gen Bank中嗜酸乳杆菌ATCC4356基因序列一致,表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western Blot检测表达的重组蛋白相对分子质量分别约为59000(含GGDEF结构域)、67000(含EAL结构域)和72000(含EAL结构域),与预期大小吻合。经树脂亲和柱纯化及浓缩获得目的蛋白。高效液相色谱分析结果显示,NH13_07045-GGDEF的表达产物体外无明显双鸟苷酸环化酶(DGC)活性,NH13_07050的表达产物体外具有磷酸二酯酶(PDE)活性,而NH13_07055的表达产物在体外无明显PDE活性。结论在本研究的3种基因中,NH13_07050的表达产物在体外具有磷酸二酯酶(PDE)的活性。为研究环二鸟苷酸在嗜酸乳杆菌中的调控机制提供了实验依据。
- 何嘉辉孙洁丽闫文娟王方
- 关键词：嗜酸乳杆菌酶活性检测
- RgpAc基因对变形链球菌生物学特性影响的研究
- 2013年
- 目的:研究变形链球菌RgpAc基因缺失对生物膜形成、生物膜结构及细菌胞外多糖形成的影响。方法:采用变形链球菌野生菌株和RgpAc基因敲除菌株,分别进行生物膜形成量的测定、生物膜结构的扫描电镜观察及细菌胞外多糖形成量的实验,对结果进行统计学分析处理。结果:变形链球菌RgpAc基因敲除菌株的生物膜形成量比野生菌株少,差异有统计学意义。低倍电镜下观察生物膜结构菲薄松散,细菌在釉质表面的粘附量少,高倍电镜下观察细胞外基质减少。结论:变形链球菌RgpAc基因被敲除后,细菌合成胞外多糖的能力下降,从而导致变形链球菌生物膜形成能力下降,结构疏松,同时细菌产糖量下降,细菌对生物膜的粘附性降低。
- 谢苗苗吴补领闫文娟
- 关键词：变形链球菌生物膜
- 变形链球菌gcp基因失活菌株生物膜形成能力及在唾液包被羟基磷灰石表面的黏附率被引量：1
- 2012年
- 背景:前期实验发现外源性单磷酸鸟苷环二聚体能够抑制变形链球菌生物膜的形成及其体外黏附能力。变形链球菌内部存在的单磷酸鸟苷环二聚体是否具有同样作用。目的:成功构建了变形链球菌内部单磷酸鸟苷环二聚体相关基因gcp的失活菌株,观察gcp基因失活后变形链球菌生物学特性的改变。方法:将gcp失活菌和野生菌菌悬液在96孔酶标板中厌氧培养48h,用结晶紫染色,乙醇/丙酮混合液显色,测量A575nm值,以定量反映生物膜形成量;荧光标记gcp失活菌和野生菌,与唾液包被的羟基磷灰石粉末共同孵育后,测定羟基磷灰石沉淀的荧光值,比较黏附率的差异。结果与结论:gcp失活菌生物膜形成量低于野生菌,gcp失活菌在唾液包被羟基磷灰石表面的黏附率低于野生菌(P<0.05)。提示gcp基因的失活可抑制变形链球菌生物膜形成能力及在生物体表面的黏附。
- 闫文娟
- 关键词：变形链球菌GCP基因失活生物膜
- 变形链球菌gcp基因敲除菌株表达谱基因芯片被引量：1
- 2013年
- 背景:前期研究中经证实变形链球菌内部存在单磷酸鸟苷环二聚体信号通路,构建了变形链球菌 gcp 基因敲除菌株。目的:比较变形链球菌野生菌种和 gcp 基因突变菌株基因表达的差异情况,筛选与生物膜相关的基因,进入后续研究。方法:提取两种细菌的总 RNA,反转录后分别用 cy3 和 cy5 染色。与基因芯片杂交后,扫描结果,进行数据分析,获取差异基因信息,对筛选的基因进行 Real-Time PCR 验证。结果与结论:差异基因主要与糖代谢、生物膜形成有关,选择了 2 个基因进行验证,PCR 结果与芯片结果相符合。变形链球菌 gcp 基因敲除后,突变菌株 ahpC 基因表达上调,磷酸转移酶系统基因表达下调,说明这 2个基因与 c-di-GMP 信号通路的下游途径相关。
- 谢苗苗胡晓聪吴补领闫文娟
- 关键词：变形链球菌基因芯片C-DI-GMPAHPC国家自然科学基金
- 变形链球菌gcp基因突变菌株的构建及鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的:构建变形链球菌gcp基因突变菌株,以便研究变形链球菌gcp基因功能。方法:厌氧培养变形链球菌UA159,以前期研究中pMD19T-gcp为模板,PCR扩增gcp基因内部序列,连接自杀载体pVA8912,酶切鉴定;将鉴定正确的质粒转化变形链球菌UA159,挑取阳性克隆,提取基因组DNA,用PCR结合酶切鉴定。结果:发现PCR产物及插入片段大小与预期值相符,表明成功构建了重组质粒pVA8912/gcp;经PCR鉴定:gcp基因失活株基因组中gcp基因内部成功插入了重组载体片段。结论:成功构建了变形链球菌gcp基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础。
- 闫文娟杨德鸿吴补领
- 关键词：变形链球菌基因失活GCP聚合酶链反应
- 外源性单磷酸鸟苷环二聚体抑制变形链球菌生物膜的形成能力被引量：4
- 2012年
- 背景:有研究发现外源性的单磷酸鸟苷环二聚体(bis-(3'-5')-cyclic dimeric guanosinemonophosphate,c-di-GMP)能够抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,且作用呈剂量依赖性。目的:观察外源性c-di-GMP对变形链球菌生物膜形成能力的影响。方法:将不同浓度(0,2,20,200,400μmol/L)外源性c-di-GMP作用于变形链球菌生物膜48h,使用酶标仪测定吸光度值,观测生物膜形成量的改变,以生理盐水作为阴性对照。同时在离体牙的新鲜釉质片上形成变形链球菌生物膜,以200μmol/L的c-di-GMP与生理盐水分别作用于生物膜48h,扫描电镜观察结构的改变。结果与结论:与阴性对照组比较,c-di-GMP明显抑制了变形链球菌生物膜的形成,而且这种抑制成剂量依赖关系,当c-di-GMP浓度为200μmol/L时,变形链球菌生物膜的形成能力下降了65%左右,达到400μmol/L时,生物膜的形成能力几乎被完全抑制(P<0.05)。扫描电镜结果显示,c-di-GMP处理组细菌排列无明显规律,细胞外基质减少。表明c-di-GMP可以抑制变形链球菌的生物膜形成能力。
- 闫文娟
- 关键词：变形链球菌生物膜金黄色葡萄球菌龋齿外源性
- 外源性单磷酸鸟苷环二聚体对变形链球菌基因表达的影响被引量：4
- 2012年
- 背景:前期研究证实变形链球菌内部存在单磷酸鸟苷环二聚体信号通路,该通路介导变形链球菌的生物膜形成及在体外牙釉质表面的黏附。目的:以基因芯片技术分析单磷酸鸟苷环二聚体对变形链球菌生物学特性的影响。方法:以外源性单磷酸鸟苷环二聚体干预变形链球菌UA159,提取其总RNA,并以标准菌株的总RNA作为对照,与变形链球菌全基因组芯片杂交,筛选差异基因。结果与结论:外源性单磷酸鸟苷环二聚体干预后,变形链球菌中glgA、glgB、msmF、gftA、lacG、lepB、rgpAc、bacC、apt69个基因表达上调,Hrc、ProC、HprT、Pdp、Glk、cdsA共6个基因表达下调。所获得的差异基因主要与细胞趋向性和生物膜形成、信号转导、糖代谢、等途径相关。说明单磷酸鸟苷环二聚体影响变形链球菌的致龋性。
- 闫文娟徐树军徐树军谢苗苗
- 关键词：基因芯片变形链球菌生物膜致龋性
