国家自然科学基金(30730095)
- 作品数：15 被引量：19H指数：2
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- 犬同种异体椎间盘复合髓核细胞移植初探被引量：1
- 2012年
- 目的：探讨同种异体椎间盘复合髓核细胞移植的转归，观察转人端粒酶逆转录酶human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因髓核细胞介入椎间盘移植的生物学效应。方法：常规分离8周龄比格犬髓核细胞，将PKH-26标记的传2代髓核细胞（NPc）和转hTERT基因髓核细胞（hTERT—NPc）分别注射入冷冻保存的同种异体椎间盘内构建组织工程化同种异体椎间盘。选择12月龄同种犬18只随机分为3组，分别植入hTERT—NPc组织工程化的同种异体椎间盘（A组）、NPc组织工程化的同种异体椎间盘（B组）以及未组织工程化的同种异体椎间盘（C组）。每只犬于术后4、8、12周行正侧位X线片及MRI检查，观察移植椎间盘同宿主椎体愈合情况、移植椎间盘高度和信号变化情况：手术后12周麻醉状态下处死实验动物取L1～L7段脊柱标本进行生物力学测试，取移植椎间盘进行组织学观察。结果：X线及MRI检查结果显示3组移植椎间盘与宿主椎体均实现了良好的骨性融合，其中C组椎间盘术后出现了呈进展趋势的退行性改变，至移植后12周，其椎间盘高度及髓核信号比灰度值明显低于A、B两组（P〈0．05）。生物力学显示术后12周时，C组移植椎间盘在屈伸和旋转方向的活动度显著性大于A、B两组（P〈0．05），A组与B组无显著性差异（P〉0．05）。激光共聚焦显微镜观察到A、B组移植椎间盘髓核区域内有红色荧光细胞；光学显微镜下观察A、B两组移植椎间盘结构保持较好，外形类似软骨细胞的髓核细胞数量较多，排列较为规则；C组髓核形态保持欠佳，结构较为紊乱，髓核细胞数量明显减少，细胞形态欠饱满，退行性改变明显。RT—PCR分析显示术后12周时A组髓核内可检测到hTERTmRNA的阳性表达。结论：犬同种异体椎间盘移植后可在宿主体内存活，通过复合NPc可延缓椎间盘移植后的退行性改�
- 辛洪奎张超王德利吴剑宏王超峰何勍阮狄克
- 关键词：椎间盘退变椎间盘移植同种异体人端粒酶逆转录酶髓核细胞
- 重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因转染对人髓核细胞功能的影响被引量：2
- 2012年
- 目的:研究重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因(recombinant adenoassociated virus vector-me-diated human telomerase reverse transcriptase,rAAV-hTERT)转染对体外培养人髓核细胞功能的影响。方法:利用机械与酶消化的方法获得均一性的人椎间盘髓核细胞,将构建好的rAAV-hTERT转染P2代体外单层培养的髓核细胞。用重组腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinant adenoassociated virus vector-mediatedenhanced green fluorescent protein,rAAV-EGFP)作为标记基因观察细胞转染效率,按感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)103、104、105病毒基因组拷贝数/细胞(vector genomes/cell,v.g/cell)设组,流式细胞仪检测,筛选病毒转染的最佳MOI;设立rAAV-hTERT转染组、AAV空病毒转染组及空白细胞对照组,用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reareaction,RT-PCR)及免疫印迹(Western-blot)方法检测rAAV-hTERT转染后hTERT基因在髓核细胞内的表达,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)及酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent,ELISA)检测髓核细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖能力的变化。结果:rAAV-EGFP转染细胞后第7天时,MOI为105v.g/cell组转染效率可达73.9%,明显高于MOI 103、104v.g/cell组(P<0.05);rAAV-hTERT转染组在转染后的第7、60、90、120天均可检测到hTERT基因的表达,而其他两组则无表达;转染rAAV-hTERT后120d之前,rAAV-hTERT转染组分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原较其他两组均明显增高(P<0.05),而两对照组之间则始终无明显差异(P>0.05)。结论:rAAV-hTERT能成功转染人椎间盘髓核细胞并正确表达,rAAV-hTERT转染能有效延长髓核细胞分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖功能。
- 吴剑宏阮狄克王德利张超何勍王超锋张燕辛洪奎顾韬徐成刘玥
- 关键词：髓核细胞腺相关病毒
- 组织工程复合物腰椎间盘原位植入生物力学稳定性初步研究
- 2011年
- 目的 观察组织工程复合物于犬腰椎间盘原位植入后的生物力学稳定性变化.方法 以犬髓核（NP）细胞-聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（PLGA）支架构建组织工程复合物.将24只12个月龄Beagle犬随机分为4组,A组为非手术对照组,B组行腰椎4～5（L4-5）NP摘除,C组行L4-5 NP摘除＋空白支架植入,D组行L4-5NP摘除＋NP细胞-PLGA支架复合物植入.于手术后第4、8、12周处死实验动物取L1～7节段脊柱,使用MTS-858 Mini Ⅱ型生物力学实验机测量标本L4～5节段在纯力偶距下屈伸及旋转动度,行各组间L4～5节段生物力学稳定性比较.结果 B、C、D组L4～5节段生物力学稳定性较A组均有不同程度降低;B组与C组牛物力学特性差异无明显统计学意义（P＞0.05）;而D组与前两组相比稳定性有明显提高（P＜0.05）.结论 NP细胞-PLGA支架复合物腰椎间盘原位植入能够恢复失稳节段的生物力学稳定性.
- 徐成阮狄克辛洪奎李超王超锋张超
- 关键词：髓核
- 组织工程化同种异体椎间盘移植的动物实验研究被引量：1
- 2013年
- 目的观察组织工程技术的运用能否延缓椎间盘移植后的退行性改变。方法将髓核细胞复合至同种异体椎间盘,体外培养后植入犬L4/L5椎间隙作为实验组(A组),对照组(B组)行同种异体椎间盘移植。使用影像学、生物力学及组织学分析评估植入椎间盘的转归并行组间比较。结果移植椎间盘可与宿主椎体实现骨性融合。对照组椎间盘术后退变明显,12周时其椎间盘高度及髓核信号比灰度值明显低于实验组,稳定性丧失明显;组织学观察发现实验组移植椎间盘结构保持较好,髓核细胞数量较多,排列规则;对照组髓核形态保持欠佳,结构紊乱,髓核细胞数量减少,退行性改变明显。结论通过复合种子细胞实现异体椎间盘的组织工程化可有效延缓椎间盘移植后的退行性改变。
- 辛洪奎张超王德利吴剑宏王超峰何勍阮狄克
- 关键词：椎间盘犬科
- 人端粒酶逆转录酶基因转染人髓核细胞的安全性研究
- 2012年
- 目的评价人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因转染对人椎间盘髓核细胞"安全性"的影响。方法将构建好的重组腺相关病毒人端粒酶逆转录酶基因(recombinant adeno-associated virus vec-tor-mediated hTERT gene,rAAV-hTERT)按感染复数(multiplicity of infection,MOI)105 v.g每细胞转染体外培养二代髓核细胞。设立rAAV-hTERT转染组,AAV空病毒转染组及未转染组;利用RT-PCR及Western-blot检测转染后hTERT基因的表达;对体外培养120 d的细胞进行染色体核型分析;将3组细胞(100μL,3×107/mL)分别注入裸鼠腋下检测其成瘤性,以人Hela细胞为阳性成瘤实验对照。结果成功检测出rAAV-hTERT转染髓核细胞后hTERT基因的表达;G-带核型分析未见染色体结构异常克隆;3组细胞均未观察到裸鼠体内肿瘤形成。结论 rAAV-hTERT能成功转染人椎间盘髓核细胞并正确表达,rAAV-hTERT转染髓核细胞在有限的体外培养过程中是安全的,可为进一步的在体研究提供安全性证据。
- 吴剑宏阮狄克王德利张超何勍王超锋张燕辛洪奎顾韬徐成刘玥
- 关键词：腺病毒科骨髓细胞基因疗法致癌性试验
- 退行性脊柱侧弯诊治研究进展被引量：6
- 2012年
- 传统观念中，学者们对儿童和青少年的脊柱侧弯更加关注，而对成人脊柱侧弯的关注较少，对其治疗通常更倾向于保守治疗。实际退行性脊柱侧弯的成人发病人群要远大于青少年，其发病率也随着人口老龄化而逐年上升，在50岁以上人群的总发病率约为6％，而需要得到治疗的患者大多在60多岁。成人脊柱侧弯的治疗标准目前尚不统一，还存在一些争议。本文就退行性脊柱侧弯近年来的诊治研究进展做一综述。
- 何勍吴剑宏
- 关键词：脊柱侧凸退行性
- 深低温保存温度及时间对椎间盘生物活性的影响被引量：2
- 2011年
- 目的:探讨深低温保存温度及保存时间对椎间盘生物活性的影响。方法:取1岁龄Beagle犬新鲜椎间盘72个,分为对照组(A组,n=8)、-80℃保存组(B组,n=32)和-196℃保存组(C组,n=32)。B和C组在冷冻保存液中分别保存于-80℃低温冰箱及-196℃液氮中,在保存2w、2m、6m及12m时每组每个时间点取8个椎间盘,通过溴化吡啶/二乙酸荧光素(EB/FDA)荧光染色法检测椎间盘组织中不同部位的细胞存活率,以二甲基亚甲蓝(DMMB)染色法检测髓核组织蛋白多糖(PG)含量,以羟脯氨酸检测法测定纤维环组织中的总胶原含量;对照组取标本后直接进行以上检测。结果:B和C组椎间盘在保存至2w时各部位细胞存活率较A组明显下降,2m^12m保存期间,B、C两组椎间盘各部位的细胞存活率均维持在相对恒定的水平,但均较2w时下降;B组及C组外层纤维环细胞存活率在保存2w和2m时无明显差别(P>0.05),在保存6m及12m时C组明显高于B组(P<0.05);C组内层纤维环及髓核组织细胞存活率在各检测时间点均明显高B组(P<0.05)。B、C两组在各检测时间点PG含量均较A组明显降低,在保存2m^12m期间,C组PG含量均高于B组(P<0.05)。B、C两组总胶原蛋白含量在保存期间随时间逐渐降低,但两组间未见明显差异(P>0.05)。结论:利用-196℃保存椎间盘组织,无论在细胞总的存活率及PG含量上均优于-80℃保存;-196℃保存12个月时椎间盘细胞存活率及PG含量均维持在相对稳定的水平,能满足同种异体椎间盘移植的要求。
- 王超锋阮狄克张超辛洪奎徐成
- 关键词：椎间盘深低温保存细胞活性细胞存活率
- 人端粒酶逆转录酶基因转染对犬髓核细胞生物学活性的影响
- 2012年
- 目的观察2型重组腺相关病毒-人端粒酶逆转录酶(recombinant adeno-associated virus type-2human telomerase reverse transcriptase,rAAV2-hTERT)病毒载体转染对犬髓核细胞生物学活性的影响。方法实验组常规分离犬髓核细胞,rAAV2-hTERT病毒载体以1×105v.g/cell的复合感染转染犬髓核细胞。在转染后5、10、15、30 d及60 d分别以反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western-blot方法检测髓核细胞中hTERT mRNA及蛋白的表达;利用实时定量PCR、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法分别检测髓核细胞蛋白多糖(proteoglycan,PG)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原(collagen typeⅡ,COL2)mRNA及蛋白表达量。所有检测均与2型重组腺相关病毒-增强绿色荧光蛋白(recombinant adeno-associated virus type-2 enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染的髓核细胞(对照组)进行对比。结果 rAAV2可成功转染犬髓核细胞,在转染后5、10、15、30 d以及60 d,均可于基因和蛋白水平检测到hTERT基因在髓核细胞内的表达;而在所有观察时间点内,对照组未能检测到hTERT基因表达。RT-PCR显示在转染后的10～60 d,实验组PG、COL2 mRNA的表达量明显高于对照组细胞的mRNA表达,实验组与对照组在COL1 mRNA表达上无明显差别。ELISA测定蛋白多糖及COL2表达量提示:在转染后10 d,实验组髓核细胞PG、COL2的表达量显著增加;在转染后的10～60 d,实验组髓核细胞PG、COL2的表达量均明显高于对照组。结论使用rAAV2-hTERT病毒转染可成功实现体外培养条件下髓核细胞增殖能力及细胞外基质表达的上调,这将有可能为椎间盘退行性疾病的生物治疗提供更为理想的种子细胞选择。
- 辛洪奎张超王德利吴剑宏王超峰何勍阮狄克
- 关键词：髓核细胞人端粒酶逆转录酶基因转染
- γ射线照射对椎间盘生物学活性的影响
- 2012年
- 目的探讨γ射线照射处理异体椎间盘的可行性,同时进一步评估去细胞化椎间盘作为自然支架辅助生物学治疗椎间盘退变的性能。方法手术获取6例成熟比格犬的椎间盘,逐级冷冻保存,随机分为对照组及18 kGy、25 kGy、50 kGyγ射线照射组(n=8),处理各组椎间盘后进行细胞活性及生物力学检测并进行对比分析。结果椎间盘细胞活性与照射剂量成负相关,对照组纤维环及髓核细胞活性分别为92.6%、90.7%,18 kGy照射组为76.5%、70.6%,25 kGy照射组为52.7%、46.9%,50 kGy照射组为18.3%、10.1%,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。不同组间椎间盘生物力学性能差异均无统计学意义(P>0.05),其中压缩、拉伸轴向力及左/右旋转扭力矩均维持在正常水平。结论优化γ射线照射可以作为异体椎间盘消毒灭菌的手段,但其确切效果有待体内实验进一步验证。去细胞化椎间盘具有较为理想的生物学及机械性能,有望作为自然支架用于椎间盘疾病的相关研究。
- 丁宇阮狄克何勍王超锋
- 关键词：椎间盘骨移植Γ射线细胞存活
- 人髓核软骨样细胞的生物学特性观察被引量：2
- 2008年
- 目的:探讨人髓核软骨样细胞的生物学特性,为组织工程椎间盘种子细胞的选取提供依据。方法:髓核组织取材于3例脊柱侧凸行前路矫形手术者(年龄11～13岁),依次用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶分离髓核细胞,用含10%胎牛血清(FBS)的F12培养液培养细胞,取传1～7代次细胞进行光镜、电镜检查,观察细胞形态学改变,对细胞计数、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)摄取进行比较,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白信使RNA(mRNA)的表达情况。结果:体外培养条件下,传3代之前的细胞形态正常,胞浆丰富;传4代起,部分细胞的形态逐渐向长梭形演化。与传1代细胞相比,传2、3代细胞数量增殖无明显减缓(P>0.05),传4代细胞第4天开始生长减慢(P<0.05),传5～7代细胞第2天即较转1代细胞数量明显减少(P<0.05)。传1～3代细胞的MTT摄取吸光度值差异无统计学意义(P>0.05),和传1代相比,传4代具有统计学差异(P<0.05),传5～7代的差异更显著(P<0.01)。聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原在传3代之前各代次的mRNA表达量间无统计学差异(P>0.05),和传1代相比,Ⅱ型胶原从第4代起表达量显著下降(P<0.05),聚集蛋白聚糖从第5代起表达量显著下降(P<0.05),而从传5代起髓核软骨样细胞开始表达Ⅰ型胶原。结论:髓核细胞传代后前3代细胞形态良好,增殖能力强,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达良好,适合作为组织工程椎间盘的种子细胞。
- 张荣峰阮狄克张超辛洪奎
- 关键词：髓核细胞培养聚集蛋白聚糖
