国家自然科学基金(31170029)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 相关作者：钟辉魏从文汪莹王文军张部昌更多>>
- 相关机构：安徽大学军事医学科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 前半胱天冬酶-1及活性位点突变真核表达载体的构建、表达及生物活性鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的构建和表达前半胱天冬酶(procaspase)-1及其活性位点C285A突变真核表达载体,并检测其生物学活性。方法从人胚肾细胞系HEK293中提取总RNA,逆转录后,PCR获得前半胱天冬酶-1全长DNA,并通过重组PCR获得其酶活性位点突变片段,酶切连接到载体pcDNA3-Flag中,经鉴定将阳性克隆测序;脂质体转染两种载体到HEK293中表达,用免疫印迹检测目的蛋白的表达,并用酶联免疫吸附方法检测在病原菌毒力蛋白刺激下,前半胱天冬酶-1及C285A对IL-1β分泌的影响。结果构建的2种真核表达载体能够在HEK293中很好表达,当前半胱天冬酶-1过表达时,病原菌毒力蛋白可以刺激IL-1β的分泌,而C285A酶活性位点突变之后,IL-1β的分泌明显降低。结论构建重组的pcDNA3-Flag-procaspase-1具有生物学活性,而C285A突变导致前半胱天冬酶1丧失切割底物的功能,且使IL-1β的分泌明显降低。
- 汪莹王文军魏从文郑子瑞张艳红张部昌钟辉
- 关键词：炎症反应IL-1Β
- 鼠疫耶尔森菌YopJ基因突变体构建、表达及其在RLR信号通路中生物活性的鉴定
- 2014年
- 目的构建和表达鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)效应蛋白YopJ C172A、F177L、K206E突变真核表达载体,并检测其在RIGⅠ样受体(RLR)信号通路中的生物活性。方法通过PCR和测序检测pCMV-Myc-YopJ的准确性,将重组PCR技术获得的3种突变体的突变片段定向克隆到pCMV-Myc载体中,在HEK293细胞中瞬时表达,并利用荧光素酶报告基因技术检测YopJ及其3种突变体对环二鸟苷酸(c-di-GMP)激活干扰素-β(IFN-β)转录活性的影响。结果成功构建3种突变的真核表达质粒,在c-di-GMP刺激情况下,YopJ F177L、YopJ K206E与YopJ相比,对IFN-β转录活性的抑制作用没有显著差异,而YopJ C172A与YopJ有极显著差异,对IFN-β的抑制作用明显降低。结论 YopJ 172位是其抑制RLR信号通路的酶活性位点,与文献报道一致,而177位或206位则没有这种作用,这为进一步探究YopJ参与Y.pestis致病性的作用靶点和机制打下了良好基础。
- 曹叶马胜利何湘钟辉魏从文
- 关键词：突变体真核表达荧光素酶报告基因
