浙江省科技厅重点资助项目(2004C23018)
- 作品数：4 被引量：5H指数：1
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- aac(3)-Ⅱ／tem-105融合基因的构建、克隆及表达
- 目的了解aac(3)-Ⅱ／tem-105融合基因表达的融合蛋白酶与单个基因表达的蛋白酶在活性上的差异。方法应用PCR重叠延伸技术将aac(3)-Ⅱ基因和tem-105基因通过一疏水性多肽接头 (Gly4Ser)3前后拼接...
- 陈云波王震查长森吕建新
- 关键词：融合基因抗生素耐药性
- 文献传递
- MC4100突变株的ompR缺失菌的构建及其功能分析
- 目的:构建ompR缺失的突变菌株,探讨ompR调节蛋白对菌株外膜通透性影响。进一步构建和分析突变的ompR蛋白对细菌外膜通透性的影响。方法:通过交叉重叠PCR得到删除ompR的DNA片段,该片段通过限制性内切酶SalⅠ,...
- 黄雪芳谭国强孙荷丁焕根吕建新
- 关键词：同源重组基因敲除OMPR外膜蛋白
- 文献传递
- 肺炎克雷伯菌耐氨基糖苷类抗生素基因aac(3)-I的改构与功能
- 2007年
- 研究氨基糖苷乙酰转移酶基因aac(3)-I碱基变异与功能的关系。构建表达载体pET28a-aac(3)-I,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),筛选到阳性克隆送测序。然后在体外对aac(3)-I基因进行易错PCR改造,筛选到一株阳性克隆测序后发现7处碱基变异,其中C272T、T373C引发了氨基酸的变异,分别对应:Ser91Phe、Tyr125His。以琼脂稀释法检测不同克隆的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。实验结果表明变异株MIC较突变前下降64倍(庆大霉素)、4倍(阿米卡星)、8倍(依替米星)。为进一步了解和阐明耐药酶AAC(3)-I与底物的作用机制打下基础。
- 查长森王震吕建新陈云波邹立林季敬璋彭颖明镇寰
- 关键词：易错PCR最低抑菌浓度
- 氨基糖苷-(3)-乙酰转移酶II的表达纯化及初步活性
- 2007年
- 用PCR扩增的氨基糖苷-(3)-乙酰转移酶II[aac(3)-II]基因构建了能表达较高活性AAC(3)-II的重组工程菌,并获取重组AAC(3)-II。含pET28a质粒的工程菌转入aac(3)-II基因前后对氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度进行比较,重组菌超声裂解上清液及其纯化的AAC(3)-II进行SDS-PAGE和Western印迹电泳鉴定。最低抑菌浓度表明转入aac(3)-II基因的工程菌比未转入的工程菌对庆大霉素(gentamicin,GEN)的提高了256倍,对妥布霉素(tobramycin,TOB)及其奈替米星(netilmicin,NTL)提高了16倍,电泳鉴定表明纯化获取的是重组AAC(3)-II,其相对分子质量约为32kDa,纯度大于95%,纯化后的10μgAAC(3)-II,分别在10s内使80μgGEN、30s内使80μgTOB和NTL乙酰化而失去抑菌作用。研究为氨基糖苷类抗生素伴侣的开发研究初步打下基础。
- 王震陈云波查长森邹立林彭颖季敬璋陈秀枢吕建新
- 关键词：最低抑菌浓度氨基糖苷类抗生素
- AAC(3)-Ⅱ耐药酶的表达纯化及初步活性的研究
- 目的在大肠杆菌中表达sac(3)-Ⅱ基因获取的有活性AAC(3)-Ⅱ酶,为进一步开发氨基糖苷类抗生素伴侣打下基础。方法将aac(3)-Ⅱ基因重组到表达载体pET28a中,构建pET28-aac(3)-Ⅱ表达质粒,再将重组...
- 王震陈云波查长森吕建新
- 文献传递
- 肺炎克雷伯菌耐氨基糖苷类抗生素基因aac(3)-Ⅰ的改构与功能研究
- 目的研究氨基糖苷乙酰转移酶基因aac(3)-Ⅰ碱基变异与功能的关系。方法构建重组表达载体pET、28-aac(3)-Ⅰ,转化感受态E．coli BL21(DE3),经含终浓度为25μg／ml的Kan抗生素LB平板筛选得到...
- 查长森王震陈云波吕建新
- 关键词：易错PCR活性中心
- 文献传递
- CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)克隆、表达、纯化以及酶动力学的研究
- 超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLSs)是一种能水解青霉素类、头孢菌素类以及单环类抗菌药物的β-内酰胺酶,主要包括 TEM 型,SHV 型,CTX-M 型,OXA ...
- 田宇鑫王震曲建春林镯吕建新
- 关键词：CTX-M-14克隆发酵纯化
- 文献传递
- 高活性β-内酰胺酶的分离、表达和性质
- 2008年
- 应用DNA家族改组方法制备TEM型β-内酰胺酶基因突变文库，利用平皿初筛和琼脂稀释法复筛获得一株酶活力增高的突变体blaTEM^m。带有该突变基因的大肠杆菌，其最低抑菌浓度（MIC）比带有野生型blaTEM的大肠杆菌高24倍（氨苄青霉素）、4-8倍（头孢唑啉）、4-8倍（头孢呋辛）、16-32倍（头孢他啶）、8倍以上（头孢曲松）和4～8倍（头孢噻肟）。在E.coli BL21（DE3）高效表达blaTEM和blaTEM^m，利用离子交换柱层析和凝胶过滤层析对包涵体进行柱上复性和纯化，获得纯度达90％的重组蛋白质。酶动力学分析显示，与野生型蛋白相比，突变蛋白酶促反应的kcat／Km值分别增加1．5倍（青霉素G）、4．4倍（氨苄青霉素）、3．1倍（头孢唑啉）、2．8倍（头孢他啶），但是对头孢噻肟的kcat／Km下降了2．5倍。DNA序列分析显示blaTEM^m发生7处碱基置换，造成4个氨基酸改变，即S59G、R164S、A237T和E240K。应用Swiss-Pdb Viewer3．7软件预测蛋白质的三维结构，显示这些突变不影响酶的活性中心，但是变异造成的蛋白质空间结构的细微变异增加了酶和底物的亲和性。
- 赖飞田宇鑫赵峰王震吕建新
- 关键词：Β-内酰胺酶最低抑菌浓度耐药
- 大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药谱及其产ESBLs的研究被引量：5
- 2007年
- 目的了解临床分离的54株大肠埃希菌对氨基糖类苷类抗生素的耐药谱及产ESBLs情况,分析氨基糖苷类修饰酶AAC(3)-II的检出率及该酶的一些特征。方法采用MIC法测定临床分离的54株大肠埃希菌对7种氨基糖苷类抗生素的耐药谱,用NCCLS推荐的酶抑制剂增强纸片扩散法检测产ESBLs菌株,并通过聚合酶链反应、克隆测序和测定重组菌耐药谱对aac(3)-II基因进行研究。结果54株大肠埃希菌对阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、链霉素、大观霉素和奈替米星的耐药率分别为14.8%、77.8%、59.3%、66.7%、68.5%、61.1%、22.2%;共检测出产ESBLs菌株34株,占63.0%;aac(3)-II基因在54株大肠埃希菌中检出率为88.5%;质粒转化菌产ESBLs且同时检出aac(3)-II基因。重组菌BL21(DE3)/pET26::aac(3)-II对庆大霉素和卡那霉素有耐药性,对其余5种氨基糖苷类抗生素没有表现出耐药性。结论大肠埃希菌对庆大霉素的耐药率最高,对阿米卡星的耐药率最低;耐氨基糖苷类抗生素的大肠埃希菌与其产ESBLs有相关性;重组菌BL21(DE3)/pET26::aac(3)-II仅对庆大霉素和卡那霉素产生耐药。
- 陈云波王震查长森邹立林季敬章彭颖吕建新
- 关键词：大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素修饰酶超广谱Β内酰胺酶
- 硫氧还蛋白还原酶在基因敲除大肠杆菌中的克隆表达及体内外活性测定
- 目的在本室构建的基因敲除大肠杆菌中克隆表达硫氧还蛋白还原酶,构建一株对环境中氧还循环反应剂超敏感的大肠杆菌菌株。方法以野生型大肠杆菌MC4100为模板用PCR方法扩增出硫氧还蛋白还原酶基因,以pBAD为表达载体构建pBA...
- 孙荷谭国强黄雪芳丁焕根吕建新
- 关键词：硫氧还蛋白还原酶硫氧还蛋白
- 文献传递
