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嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究被引量：5: 2006年; 对来源于嗜热古菌Aeropyrum pernix的酯酶(APE1547)催化活性进行定向进化研究。利用APE1547特殊的稳定性,建立了准确的高通量高温酯酶筛选方法。对第一代随机突变库筛选获得了催化活性较野生型提高1.5倍的突变体M010,序列分析表明其氨基酸突变为R526S。从第二代突变库中筛选出的总活力提高5.8倍突变体M020,突变位点为R526S/E88G/A200T/I519L,其比活力与M010一致,但表达量比野生型提高约4倍。对M020酶学性质表征发现,其最适pH为8.5,比野生型向碱性偏移0.5;活性中心残基酸性基团的解离常数(pK1)由野生型的7.0提高至7.5。晶体结构分析表明,突变位点R526距离活性中心较近,将其突变为Ser降低了活性中心的极性,抑制了催化残基His的解离,使酸性基团的解离常数升高。; 王秋岩杨广宇刘艳莉王艳平冯雁; 关键词：定向进化嗜热酶解离常数

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究被引量：2: 2006年; 1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR)的基因dhaT,序列显示与来源于C．freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78％。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E．coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S- 300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8．0,对丙醛的Km值为10．05mmol／L,最大反应速度Vmax为37．27μmoL／min／mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10．5,对1,3-PD的Km值为1．28mmob／L,最大反应速度Vmax为25．55μmol／min／mg。重组酶的还原反应比活为49．50U／mg,氧化反应比活为79．72U／mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。; 齐向辉罗兆飞韦宇拓陈发忠王珊珊侯守海廖东庆黄日波; 关键词：1,3-丙二醇氧化还原酶克隆纯化

流感病毒神经氨酸酶抑制剂的定量构效关系(QSAR)的研究: 2008年; 以31个分子结构与生物活性(-lgIC50)已知的流感病毒神经氨酸酶抑制剂为训练集,选用16个分子的理化描述子,包括分子的形状,静电作用能和范德华作用能以及疏水描述子,用二维定量构效关系(2D-QSAR)方法建立了预测模型。计算中使用偏最小二乘(PLS)和主成分分析(PCA)降低变量维数,减少噪音干扰。用交叉验证法(leave one out,LOO)检验了预测模型的可信性,并用一个由4个抑制剂组成的测试集进一步验证预测模型的预测能力,证实了QSAR预测模型有较好的预测能力。神经氨酸酶抑制剂的QSAR预测模型的建立为抗流感药物的设计和改进提供了有用的研究工具。; 韦航杜奇石; 关键词：神经氨酸酶抑制剂抗流感药物药物设计

Aspergillus fumigatus来源植酸酶的Q23L和Q23LG272E突变研究被引量：6: 2007年; Aspergillus fumigatus来源的植酸酶具有热稳定性好、pH作用范围广的优点,但其比活性很低。设计的植酸酶Q23L突变能在pH4.5～7.0范围内大幅提高比活性,但pH稳定性却显著下降,为了进一步改良Q23L的pH稳定性,在Q23L分子上加入了G272E突变。将原酶、突变酶Q23L和突变酶Q23LG272E分别在毕赤酵母GS115中表达,表达酶经纯化后进行酶学性质比较分析,结果表明:突变酶Q23L的比活性比原酶显著提高,在pH5.5比活性由51u/mg提高到109u/mg,但其pH稳定性,尤其是在pH3.0～4.0酸性条件下的稳定性却显著降低,低于80%。突变酶Q23LG272E在pH3.0～4.5和pH6.5～7.0时的稳定性比Q23L有所提高,恢复到原酶的水平,而比活性基本维持在Q23L的水平。通过一级序列和三维结构比较,分析了可能影响Q23LG272E酶学性质的因素,为进一步研究植酸酶的结构与功能提供了材料。; 谷维娜杨培龙王亚茹罗会颖孟昆伍宁丰姚斌范云六; 关键词：植酸酶定点突变毕赤酵母

产γ-内酰胺水解酶菌株的筛选及发酵条件研究被引量：10: 2006年; (-)γ-内酰胺是合成两种抗艾滋病药物(-)carbovir和(-)abacavir的重要原料,具有重要的应用价值,微生物酶法拆分(+/-)γ-内酰胺生产(-)γ-内酰胺的方法具有良好的应用前景。以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源,从土壤中筛选得到了69株具有酰胺水解酶活性的菌株,利用液相色谱分析方法确定了其中20株有较高的酰胺水解酶活性,利用手性色谱分析的方法进一步得到了一株具有较高立体选择性,能拆分(+/-)γ-内酰胺而获得(-)γ-内酰胺的菌株L29-9,对该菌株的产酶培养基的碳、氮源及初始pH值等进行了研究。结果表明:当选择碳源柠檬酸2g/L、氮源酵母提取物5g/Lp、H 7.0、培养时间40h时,通过完整细胞转化,在30℃下经过12h的反应,产物(-)γ-内酰胺产率达40%,ee值99.5%。; 李海泉苏磊杨柳王建军郑国钧; 关键词：拆分

一种快速筛选海藻糖合成酶突变体体系的建立被引量：1: 2008年; 利用λRed重组系统对大肠杆菌JM109的6-磷酸海藻糖合成酶基因OtsA和6-磷酸海藻糖酯酶基因otsB进行敲除,获得otsA和otsB基因失活的大肠杆菌突变体,该突变体由于对渗透压变得非常敏感,在含5%NaCl和0.5%麦芽糖的培养基中生长缓慢,然而当导入有活力的外源海藻糖合成酶基因后,由于能在胞内合成海藻糖,增强了细胞抗高渗透压培养基的能力,因而可让otsA和otsB基因缺失后的JM109得以恢复其生长能力。通过比较它们在高渗透压的培养基中的生长速度,可以筛选出含有不同活力的海藻糖合成酶突变体。; 李庆业韦宇拓王倩倩刘一黄日波; 关键词：海藻糖合成酶基因基因缺失

极端嗜热微生物分子伴侣蛋白研究与嗜热功能蛋白质的规模化制备技术研究被引量：1: 2009年; 极端微生物是丰富的资源宝库,有着巨大的生物技术开发前景。本文从特殊功能蛋白质的发现与表征、结构与功能及潜在性应用,以及特殊功能蛋白质的规模化制备技术两个方面,对极端微生物的资源开发与利用进行了探讨。重点介绍了极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus分子伴侣蛋白系统的一些研究,并以P.furiosus胞外α-淀粉酶PFA为例,对工业生物技术领域重组蛋白质的规模化制备技术进行了讨论。; 张毅; 关键词：极端微生物

甘油脱水酶的理性设计:基因杂合改善酶的性质被引量：1: 2006年; 1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注.以弗氏柠檬酸菌和克雷伯氏菌的总DNA以及宏基因组为模板,克隆并表达了3个不同来源的甘油脱水酶基因,前两者均有活力,而后者则没有活力.为了改造甘油脱水酶使其更有利于工业化生产,通过同源建模(homology modeling)构建了这3个甘油脱水酶的三维结构,并利用一些生物信息学软件对这3个甘油脱水酶进行亚基之间的杂合改组(gene swapping)的理性设计,根据设计结果对这3种不同来源的甘油脱水酶的大、中小亚基基因分别进行了克隆.通过基因交换的方法对甘油脱水酶大、中小亚基进行了杂合,得到6种异源亚基杂合酶.部分杂合酶的酸碱稳定性、热稳定性及Vmax得到了明显的改善,同时杂合改组使本没有活力的来源于宏基因组的甘油脱水酶具有了活力而且杂合酶的热稳定性也得到了显著提高.根据构建的三维结构分析了结构差异对酶学性质的影响.; 齐向辉罗兆飞吴杰群孟晓蕾唐悦韦宇拓黄日波; 关键词：甘油脱水酶宏基因组基因置换杂合酶

Pyrococcus furiosus小分子热休克蛋白Pfu-sHSP的克隆表达和纯化: 2009年; 用PCR扩增嗜高温菌Pyrococcus furiosus的小分子热休克蛋白基因后,克隆于质粒pT7473中.该小分子热休克蛋白Pfu-sHSP含有较多的稀有密码子,在大肠杆菌BL21(DE)3几乎无表达,而在带有大肠杆菌稀有密码子AGA(arg)AGG(arg),AUA(ile)和CUA(leu)的BL21—Codonplus(DE)3—RIL中能大量表达.大量表达Pfu-sHSP蛋白的细胞用超声波破碎后,离心沉淀用85℃水浴20 min,再离心,上清液再以Q Sepha-rose Fast Flow阴离子交换和S-200凝胶过滤层析进一步纯化,可以得到90%以上的蛋白.; 陈华友谭小力张志燕褚仲梅; 关键词：小分子热休克蛋白 PYROCOCCUS 分子伴侣

Thermobifida fusca海藻糖合成酶的定点突变及其动力学性质研究被引量：2: 2007年; 对Thermobifida fusca海藻糖合成酶(TreS)保守区域的氨基酸残基I224、N242、Q333、E352和N415进行定点突变,结果表明:位点I224、N242、N415突变后酶的活力与野生型TreS相近,E352位点突变后酶的比活力提高为野生型TreS的1.25倍。突变酶的最适温度、pH、Km和Kcat没有明显变化;突变Q333R则使TreS丧失了酶活力。; 王青艳陈发忠黄福宝韦传东韦宇拓黄日波; 关键词：海藻糖合成酶定点突变

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国家重点基础研究发展计划(2004CB719606)

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