国家高技术研究发展计划(2007AA02Z412)
- 作品数：14 被引量：84H指数：6
- 相关作者：陈泽良王玉飞黄留玉汪舟佳杜昕颖更多>>
- 相关机构：军事医学科学院吉林大学兰州大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 布鲁氏菌BP26基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立被引量：9
- 2009年
- 【目的】由于现有的减毒活疫苗仍存在较强的毒力,因抗原与毒株的差异不大而很难区分疫苗免疫和自然感染等缺点,限制了现有布鲁氏菌减毒活疫苗的广泛应用。本文拟对布鲁氏菌的减毒活疫苗株M5进行遗传改造,克服这些缺点。【方法】本研究利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了布鲁氏菌减毒疫苗株M5的BP26基因,得到了新的标记疫苗株M5ΔBP26。分别用标记疫苗株和野生株侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析标记株在细胞内和小鼠体内的存活能力。根据种特异性保守基因dnaK和缺失的BP26基因设计引物,建立双重PCR,用于区分标记株与野生株。【结果】成功构建了BP26基因标记疫苗株,细胞实验和动物实验结果表明,标记株仍能在胞内和小鼠内存活,具备作为减毒活疫苗的特性。小鼠实验结果显示,感染后两周野生株的细菌数为102.9,而突变株为101.1(P<0.01),至第3周野生株的细菌数为102.2,而突变株未能检出,表明与原疫苗株相比,标记株的感染力进一步减弱。根据DNA序列的差异,建立了能够区分标记疫苗株与野生株的双重PCR方法,标记株因只能扩增出一条带而能与野生株和毒株相区分,从而可以区分自然感染和疫苗免疫。【结论】基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立,为布鲁氏菌疫苗的进一步研发奠定了基础。
- 汪舟佳甄清乔凤王玉飞杜昕颖钟志军赵瑾于雅琴黄留玉孙岩松陈泽良
- 关键词：布鲁氏菌
- 布鲁氏菌Omp25的表达及抗原性分析被引量：3
- 2009年
- 克隆羊外膜蛋白Omp25基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对Omp25蛋白的抗原性进行分析。以布鲁氏菌染色体DNA模板,扩增Omp25基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠杆菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blotting鉴定Omp25蛋白的免疫原性。将Omp25克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠杆菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 000的融合蛋白。Western blotting分析表明,所表达的蛋白具有免疫原性。结果表明,成功地表达并纯化了Omp25蛋白,而且纯化的蛋白具有一定的免疫原性。本试验为进一步研究Omp25蛋白的功能以及寻找布鲁氏菌的诊断性蛋白奠定了基础。
- 邱业峰徐杰王玉飞赵瑾乔凤钟志军汪舟佳杜昕颖曲勍陈泽良
- 关键词：布鲁氏菌原核表达免疫原性
- 布鲁菌抗原的快速克隆与高效表达被引量：2
- 2010年
- 目的:通过Gateway技术构建布鲁菌抗原表达载体,并筛选出高效可溶性表达载体。方法:以山羊布鲁菌16M株染色体DNA为模板,扩增4个布鲁菌抗原基因BMEI2002、BMEI1069、BMEI1483和BMEI0748,利用GatewayBP反应将基因克隆到入门载体pDONR201中,构建重组质粒,然后用Gateway LR反应将基因重组到3种表达载体(pDEST17、pHXGWA、pHGGWA)中,构建相应的重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3)并诱导表达,分析利用3个不同载体所表达蛋白的表达量及表达形式。结果:利用BP反应构建了4个基因的重组质粒,用LR反应将这些基因分别克隆到表达载体,构建得到了相应的表达载体;诱导表达后的可溶性分析显示,含6×His和TRX标签的pHXGWA所表达的蛋白在表达量和可溶性方面均优于pDEST17和pHGGWA。结论:通过Gateway技术实现了布鲁菌抗原的快速克隆,筛选到的pHXGWA可作为后续大规模克隆表达载体,为布鲁菌抗原的大规模克隆表达和保护性抗原的筛选奠定了基础。
- 徐杰于爽付思美钟志军王玉飞曲勍汪舟佳杜昕颖孙宏迪白耀霞黄留玉高岚陈泽良
- 关键词：GATEWAY布鲁菌蛋白表达
- 质粒拯救法克隆细菌基因组大片段被引量：6
- 2008年
- 【目的】细菌基因组大片段尤其是基因簇的克隆与操作,是细菌基因功能分析的一个难点。基因组测序工作的不断完成和序列信息的大量积累,为细菌基因组DNA的操作提供了方便。本文报道了利用细菌的全基因组信息和质粒拯救法的原理建立的一种克隆细菌基因组大片段的方法。【方法】首先,根据基因组序列信息,在待克隆片段的一侧扩增一段DNA,并将其克隆到自杀载体上构建打靶质粒,然后,将打靶质粒整合到细菌的基因组中构建重组菌,提取重组菌的基因组DNA,酶切,自连,转化,将自杀质粒与待克隆的目的片段一起拯救出来。最后,根据需要将拯救的DNA片段亚克隆到新的载体中。【结果】我们利用该方法克隆了布鲁氏菌中长度为11kb的virB操纵子,并构建了互补质粒。将该质粒导入到virB的突变株中后使virB操纵子的转录活性得到了恢复,表明该策略切实可行。【结论】这种重组克隆策略给我们提供了一种新的对细菌基因组大片段进行操作的方法。
- 王玉飞陈泽良乔凤杜昕颖贾雷立袁静黄留玉
- 关键词：细菌基因组
- 不同因素对绵羊同期发情的影响被引量：15
- 2008年
- 用CIDR(阴道栓)和PMSG(孕马血清促性腺激素)处理小尾寒羊、蒙古绵羊、小尾寒羊和东北绵羊的杂交品种,注射PMSG后24h引入试情公羊,以便确定母羊是否发情。实验结果表明:在繁殖季节,不同品种绵羊的同期发情率无显著差异(P>0.05);季节影响小尾寒羊的同期发情效果;阴道栓放置时间的长短影响同期发情率,以12～14d为宜;用450UPMSG处理羊比400U的只平均排卵数稍高(1.545±0.741n=299,1.505±0.647n=88),但不存在统计学上的差异(P>0.05).
- 李秋艳阎凤祥侯健关宏陈永福安晓荣
- 关键词：绵羊PMSG阴道栓同期发情
- 布鲁氏菌vjbR突变株的构建及其毒力表型分析被引量：4
- 2010年
- 为分析vjbR在布鲁氏菌毒力中的作用,构建了vjbR的突变株和互补株,并分析了它们在巨噬细胞和小鼠体内的存活能力。利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了16M的vjbR(BMEII1116)基因,得到了vjbR的缺失突变株16M△vjbR。将vjbR基因的ORF克隆到pMD18-T载体中,然后将其转入到突变株16M△vjbR中得到互补株16M△vjbR-C。用16M、16M△vjbR和16M△vjbR-C侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析它们在巨噬细胞内的生存能力及小鼠毒力。研究结果表明vjbR突变株在巨噬细胞和小鼠体内的毒力减弱,存活能力下降,说明vjbR基因是布鲁氏菌16M的毒力相关基因,对于布鲁氏菌建立慢性感染是必要的。
- 付思美白耀霞曲勍徐杰王玉飞钟志军于爽王同坤杨毅陈燕芬汪舟佳杜昕颖黄留玉甄清陈泽良
- 关键词：布鲁氏菌毒力
- 布氏杆菌病致病因子及防治研究进展被引量：14
- 2008年
- 布氏杆菌是引起动物布氏杆菌病的病原。这类胞内病原菌表达一系列的因子,包括脂多糖类、毒力调节蛋白和磷酸卵磷酯等来保证其毒力。有些毒力因子是侵袭宿主所必须的,而其他的毒力因子对逃脱宿主的清除是必须的。它们允许布氏杆菌在复制泡内生存和增殖,逃脱宿主免疫系统的检测。了解其毒力可为疫苗研制提供依据,也可促使新的抗生素研制。在动物布病防治中生产兽用疫苗来预防该病,但还没有合适的疫苗防治人布病,可能是人布病复杂的病理生理学不同于动物模型。本文就布氏杆菌毒力因子以及如何操纵在宿主细胞中运输进行综述。
- 钟志军陈泽良黄克和乔凤王玉飞赵瑾汪舟佳徐杰曲勍黄留玉
- 关键词：布氏杆菌病致病因子
- 布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析被引量：6
- 2010年
- 克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。
- 徐杰王玉飞汪舟佳乔凤钟志军杜昕颖赵瑾曲勍高岚陈泽良
- 关键词：布鲁菌原核表达抗原性
- omp25c基因对马耳他布鲁菌疫苗株M5的毒力及免疫保护性的影响被引量：1
- 2009年
- 目的:初步评价马耳他布鲁菌M5疫苗株omp25c基因对其毒力及免疫保护性的影响。方法:利用同源重组的方法,用卡那霉素抗性基因替换M5的omp25c(BMEI1829)基因,得到缺失突变株M5Δomp25c;分别用M5Δomp25c和M5免疫小鼠,在免疫后不同时间点处死小鼠,通过脾脏细菌计数分析缺失突变株在小鼠体内的毒力,通过检测IgG和IFN-γ的水平分析缺失突变株在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答能力,通过攻毒实验评价突变株的免疫保护效果。结果:与M5株相比,M5Δomp25c在小鼠脾脏内的存活时间较短,在第4周时未能检出;M5Δomp25c免疫小鼠诱导产生的IgG水平在第4周达到最高,第6周开始下降;M5Δomp25c免疫小鼠诱导分泌的IFN-γ水平在第4周达到最高为790pg/mL,第6周时浓度降至530pg/mL,整体趋势显著低于阳性对照组;接种了M5Δomp25c的小鼠用布鲁菌强毒株16M攻毒后,免疫保护效果也下降。结论:缺失omp25c的突变株毒力减弱,诱导的体液和细胞免疫水平及免疫保护效果下降,说明omp25c基因是马耳他布鲁菌M5疫苗株的毒力相关基因,对疫苗株M5的免疫应答和免疫保护效果有一定的影响。
- 曲勍王玉飞乔凤钟志军徐杰杜昕颖汪舟佳赵瑾黄留玉于雅琴陈泽良
- 关键词：毒力免疫保护性
- 羊布鲁氏菌的分泌蛋白质组分析被引量：12
- 2009年
- 分泌蛋白是指那些分泌到细胞外的蛋白质。布鲁氏菌的分泌蛋白可能介导了病原与宿主之间的相互作用,在布鲁氏菌的毒力方面发挥一定的作用,但是研究方法的局限性限制了分泌蛋白的研究。本文报道了利用蛋白质组的方法来寻找羊布鲁氏菌的分泌蛋白。首先用TCA-丙酮法提取布鲁氏菌培养上清中的分泌蛋白,双向电泳进行分离,然后用质谱来鉴定这些蛋白,最终鉴定到40种蛋白。通过生物信息学分析,发现这些蛋白主要是ABC转运系统的底物结合蛋白、外膜蛋白和热休克蛋白。这些蛋白的识别不仅有助于对布鲁氏菌致病机制的理解,而且也可为布鲁氏菌病的疫苗研制提供靶标蛋白。
- 王玉飞曲勍乔凤钟志军杜昕颖汪舟佳陈泽良黄留玉
- 关键词：布鲁氏菌分泌蛋白双向电泳质谱
