北京市自然科学基金(7063094)
- 作品数：4 被引量：1H指数：1
- 相关作者：周春华赵海丹李欣欣于海单毅更多>>
- 相关机构：中国人民解放军海军总医院中国科学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA及表达载体的构建被引量：1
- 2008年
- 目的针对I型胶原α1(I)链设计、构建人鼠同源的Ⅰ型胶原siRNA(COL1A1-siRNA)及其表达载体,并证实其有效性。方法利用软件设计人鼠完全同源的一对Ⅰ型胶原siRNA序列,并构建其表达载体。直接将I型胶原siRNA和构建的质粒转染至大鼠系膜细胞,利用RT-PCR方法观察对系膜细胞I型胶原蛋白表达的抑制作用。结果Ⅰ型胶原siRNA转染至大鼠系膜细胞后,与空白对照组及MOCK组比较,能够抑制Ⅰ型胶原的表达。其质粒对Ⅰ型胶原表达的抑制作用更加显著,呈剂量依赖性。结论所设计的Ⅰ型胶原siRNA为人与大鼠完全同源的siRNA序列,所有碱基完全匹配。可以成功转染到大鼠系膜细胞,并有效抑制I型胶原在细胞内的表达。质粒载体的方法同样能够抑制Ⅰ型胶原的形成,而且表达更稳定,作用更显著。
- 李欣欣周春华于海赵海丹
- 关键词：RNA干涉肾脏纤维化
- 人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA对TGF-β_1诱导Ⅰ型胶原表达的抑制效应
- 2008年
- 目的观察人鼠同源I型胶原siRNA抑制TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原高表达的有效性。方法首先构建人鼠同源的Ⅰ型胶原siRNA表达质粒。转染大鼠系膜细胞,用RT-PCR方法观察对Ⅰ型胶原的直接抑制作用;经不同浓度(1ng、5ng、10ng)的TGF-β1刺激后,再转染Ⅰ型胶原siRNA质粒,RT-PCR方法观察其抑制效应。结果1～4μg的Ⅰ型胶原siRNA质粒均能使COL1A1基因条带表达下调,并随siRNA质粒浓度增加,抑制作用逐渐增强。大鼠系膜细胞经TGF-β1刺激,I型胶原基因表达明显增强,并具剂量依赖性。再转染Ⅰ型胶原siRNA质粒后,TGF-β1+Ⅰ型胶原siRNA质粒各组与相应浓度的单纯TGF-β1各组比较COL1A1基因条带均减弱,显示出抑制效应。结论本实验构建的人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA质粒,在大鼠系膜细胞内不仅能够直接抑制Ⅰ型胶原的基因表达,而且对TGF-β1诱导的I型胶原表达增加同样具有较好的抑制作用。本实验结果可望为肾脏纤维化的防治提供思路。
- 周春华李欣欣谭余良赵海丹于海
- 关键词：SIRNAI型胶原TGF
- 慢病毒介导I型胶原短发夹RNA转染对大鼠系膜细胞生长行为的影响
- 2010年
- 目的通过观察慢病毒介导的I型胶原（COLI）短发夹（sh）RNA感染大鼠系膜细胞后其增殖、凋亡及细胞周期的变化，探索未来应用于动物实验，甚至临床时RNA干涉（RNAi）药物对靶细胞生长行为的影响。方法利用感染增强剂（对照组）、空慢病毒载体及感染增强剂（pSC-GFP组）、COLIshRNA慢病毒表达载体及感染增强剂（pSC—GFP／COLI组）分别感染大鼠系膜细胞，用噻唑蓝法检测细胞增殖，利用AnnexinV／PE法检测细胞凋亡，利用流式细胞仪检测细胞周期，进而观察慢病毒表达载体对细胞上述能力的影响。结果pSC—GFP／COLI组和pSC—GFP组均能显著抑制细胞增殖，且慢病毒表达载体抑制能力又显著高于空病毒，分别于感染后24h、48h和72h计算抑制效率为22．52％、28．57、33．33％。凋亡实验结果表明，慢病毒感染细胞后一定程度诱导了细胞凋亡，但作为载体携带的COLIshRNA未引起进一步的细胞凋亡加剧。细胞周期实验发现慢病毒引起细胞周期阻滞于G2／M期。而在72hCOLIshRNA对s期的阻滞逐渐突出。结论慢病毒介导I型胶原短发夹RNA转染大鼠系膜细胞后，在一定程度上影响了细胞生长行为，但总体来说仍是安全的，为进一步动物实验及药物研制奠定基础。
- 单毅周春华赵海丹
- 关键词：慢病毒属胶原I型
- 慢病毒介导的Ⅰ型胶原shRNA在大鼠系膜细胞中的表达
- 2010年
- 目的探讨慢病毒介导的Ⅰ型胶原(ColⅠ)短发夹RNA(shRNA)在大鼠系膜细胞的表达情况。方法利用三质粒合成法将表达质粒合成慢病毒表达载体,分别用感染增强剂(对照组)、空慢病毒载体(pSC-GFP组)和慢病毒表达载体(pSC-GFP/ColⅠ组)感染大鼠系膜细胞。采用流式细胞仪检测各组大鼠系膜细胞的转染效率,并采用RT-PCR和Western blotting方法检测各组ColⅠmRNA及ColⅠ蛋白表达情况。结果pSC-GFP和pSC-GFP/ColⅠ均能高效感染大鼠系膜细胞,其中pSC-GFP感染效率为72.42%,pSC-GFP/ColⅠ感染效率高达75.42%。RT-PCR检测提示pSC-GFP/ColⅠ组细胞ColⅠmRNA表达量较对照组、pSC-GFP组显著降低(P<0.05),其抑制效率为32.64%±0.12%,而后两组ColⅠmRNA表达差异无统计学意义。Western blotting检测显示,与对照组、pSC-GFP组比较,pSC-GFP/ColⅠ组蛋白表达明显降低(P<0.05),而对照组与pSC-GFP组之间ColⅠ蛋白表达差异无统计学意义。结论慢病毒载体能稳定、高效地将ColⅠshRNA转染系膜细胞,并明显抑制ColⅠ的表达,为肾脏纤维化的基因治疗提供了理论依据。
- 单毅周春华
- 关键词：RNA干扰慢病毒感染
