国家自然科学基金(39970735)
- 作品数：34 被引量：118H指数：6
- 相关作者：张宝仁黄盛东梅举顾俊彦徐志云更多>>
- 相关机构：第二军医大学中国医科大学附属第一医院南京军区南京总医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 血管内皮生长因子重组腺病毒转染鼠骨髓基质细胞及其产物促内皮细胞增殖的研究被引量：2
- 2005年
- 目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165(VEGF165)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后对VEGF基因的转录、表达及其产物生物活性的影响。方法体外培养4只大鼠骨髓基质细胞,用携带VEGF165基因的重组腺病毒转染培养细胞;通过逆转录聚合酶链反应、免疫印记法和酶联免疫吸附法检测VEGF在转染细胞内的转录、表达和细胞外分泌情况;通过血管内皮细胞增殖实验测定转染VEGF165基因后的BMSCs培养上清中VEGF蛋白的生物活性。结果腺病毒介导VEGF165基因转染BMSCs后可以获得有效的转录及表达,其分泌于培养上清中的表达产物可明显促进大鼠主动脉血管内皮细胞的增殖(P<001),具有很强的生物学活性。结论腺病毒可安全、有效地转染BMSCs,VEGF165基因转染的鼠BMSCs可有效表达具有生物活性的VEGF蛋白。
- 肖海波梅举张宝仁黄盛东
- 关键词：VEGF165转染血管内皮生长因子骨髓基质细胞重组腺病毒BMSC
- 酸性成纤维细胞生长因子基因转染猪慢性缺血心肌促进侧支血管的增生被引量：1
- 2003年
- 目的 :探讨人酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)基因重组腺病毒载体 (Ad .aFGF)转染缺血心肌后促进侧支血管增生的作用。 方法 :实验用小型猪开胸于左冠回旋支 (Lcx)放置Ameroid环 ,4周后 ,将Ad .aFGF(n =7)、Ad .Null(n =6 )、PBS (n =6 )直接注射到Lcx供血区域 ,每只 10点 ,每点 10 9pfu或 10 0 μl;4周后心脏超声检测局部心功能的改善 ,体外冠状动脉造影观察侧支血管的增生 ,注射点心肌Ⅷ因子免疫组化染色检测心肌中的新生血管。 结果 :冠状动脉造影显示Ad .aFGF组较其他两组心肌中有明显的侧支血管增生 ,局部室壁功能显著提高 ;Ⅷ因子免疫组化染色显示Ad .aFGF组心肌中新生血管的密度显著高于另两组 (P <0 .0 1)。结论 :Ad .aFGF转染慢性缺血心肌后可促进侧支血管增生 。
- 顾俊彦黄盛东梅举朱泉芳张宝仁蔡凯华徐志云
- 关键词：酸性成纤维细胞生长因子腺病毒载体生理性
- 人酸性成纤维细胞生长因子基因重组腺病毒粘粒载体的构建
- 2002年
- 目的 :构建人酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)重组腺病毒粘粒载体。方法 :抽取人胎脑组织mRNA ,经RT PCR获取aFGF基因 ,测序后将其插入腺病毒粘粒载体pAxCAwt的SwaI位点。结果 :RT PCR合成的DNA片段经克隆、测序后证实为aFGF基因 ,酶切结果显示 ,aFGF腺病毒重组粘粒 (pAxCAwt aFGF)中aFGF的插入方向正确。结论 :构建的aFGF腺病毒重组粘粒 (pAxCAwt aFGF)可用于进一步的基因治疗的研究中 。
- 章斌梅举张宝仁顾俊彦
- 关键词：人酸性成纤维细胞生长因子AFGF基因重组CHD
- 大鼠骨髓单个核细胞体外诱导向内皮分化的研究被引量：6
- 2004年
- 目的 :为组织工程研究作准备 ,分离大鼠骨髓单个核细胞并诱导培养向内皮分化。方法 :成年SD大鼠 ,应用Ficoll淋巴细胞分离液 (密度1 .0 77g/ml) ,将长骨骨髓经非连续密度梯度离心 ,收集中层的单个核细胞 ,加入诱导培养基并置于纤维连接素包被的培养板上进行诱导分化 ,观察细胞生长状况 ,以透射电镜及Ⅷ因子、CD3 1、Lectin免疫组化以及流式细胞仪方法对培养细胞进行鉴定。结果 :细胞圆形、纺锤形单层融合贴壁生长 ;Ⅷ因子、CD3 1、Lectin免疫组化染色阳性 ;透射电镜显示细胞具有内皮特征性的Weibel Palade小体。结论 :采用Ficoll密度梯度离心可获得较高纯度的骨髓单个核细胞 ,经体外培养并诱导分化 。
- 肖海波梅举张宝仁黄盛东
- 关键词：骨髓单个核细胞细胞分化
- 大鼠胎心细胞的分离培养技术被引量：3
- 2003年
- 目的 :介绍一套高效率的大鼠胎心细胞的分离培养方法及其应注意的事项。方法 :无菌条件下取胎心 ,经酶解消化法分离胎心细胞 ,通过差速贴壁和添加Brdu来提高胎心细胞纯度。结果 :培养的心肌细胞的纯度可达 94% ,活细胞数 >85 % ,形态典型 ,可同步自律搏动达 2～ 3周。结论 :该方法可为实验研究提供纯度高、活细胞数较多。
- 章斌梅举张宝仁李志刚顾俊彦
- 关键词：胎心细胞培养心肌
- 血管形成素1基因对兔缺血心肌中血管的新生作用被引量：14
- 2003年
- 目的 探讨血管形成素 1基因重组腺病毒载体构建及其促进心肌缺血区血管生长的作用。方法 以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)从人脾组织获取血管形成素 1(Ang 1)全长cDNA ,经SalI酶切并克隆到E1、E3缺失的Ad5腺病毒载体 (PAxCAwt)中。应用Cosmid TPC磷酸钙共沉淀法共转染2 93细胞 ,制备了纯化的Ang 1重组腺病毒颗粒。将获得的Ang 1重组腺病毒直接注射转染 36只新西兰白兔的冠状动脉结扎后缺血的心肌内 ,应用RT PCR方法测定其在转染心肌中的表达 ,并用免疫组织化学及冠状动脉造影方法观察缺血心肌内血管生长及侧支循环形成的情况。结果 实验所克隆的Ang 1cDNA片段为含有信号肽结构的长度为 15 15bp的全长cDNA ,与文献报道一致。Ang 1重组腺病毒直接注射转染兔缺血心肌后能有效表达 ,2 8d后新生毛细血管密度及侧支循环形成明显高于对照组。结论 腺病毒介导的血管形成素 1基因能有效地促进兔心肌缺血区血管新生及侧支循环形成。
- 陈仕林张宝仁梅举徐志云朱家麟蔡凯华黄盛东刘延龄
- 关键词：基因缺血心肌血管基因治疗RT-PCR
- 复制缺陷的重组腺病毒介导的血管形成素-1基因的制备及其体外表达的研究
- 2001年
- 目的 :探讨重组腺病毒载体构建及其在体外的有效转录。 方法 :以RT PCR自人脾组织中克隆和筛选出血管形成素 1(Ang 1)全长cDNA ,测序鉴定正确后 ,经salI酶切并克隆到E1、E3 缺失的Ad5腺病毒载体 (PAxCAwt)中 ,应用cosmid TPC磷酸钙共沉淀法 ,将含有左向转录表达单元重组载体PAxCAwtAng 1与DNA 末端肽复合物(TPC)一同转染 2 93细胞中 ,经挑选克隆、病毒扩增、纯化、浓度滴度测定 ,制备了纯化病毒颗粒 ,以此转染人脐静脉上皮细胞 (ECV30 4) ,收集转染后 17天的细胞 ,用RT PCR检测转染细胞中外源性Ang 1基因转录。 结果 :实验所克隆的Ang 1DNA片段为含有信号肽结构的长度为 15 15bp的全长cDNA ,与文献报道一致。外源基因在转染细胞中能有效转录。 结论 :Ad5 PAxCAwt转导的血管形成素
- 陈仕林梅举程茅薇徐志云张宝仁黄盛东景华张石江
- 关键词：血管形成素-1腺病毒基因转染体外表达
- aFGF重组腺病毒体外诱导血管新生的实验研究被引量：2
- 2002年
- 促血管生长因子可以刺激内皮细胞分裂、分化 ,诱导血管新生。为探讨其基因转染是否具有相同的作用 ,作者用构建好的携带人酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)DNA的重组腺病毒载体 (Ad .aFGF)转染人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)。免疫荧光染色表明 ,转染了Ad .aFGF的HUVECs有明显的aFGF表达 ;ELISA检测显示aFGF能分泌至细胞外 ;MTT实验显示Ad .aFGF转染后HUVECs显著增生 ,并且当它们种植于Matrigel基质时可分化形成毛细血管样结构 ,对照组则无此现象。这些结果说明Ad .aFGF在体外具有促进血管新生的作用 。
- 顾俊彦黄盛东梅举张宝仁
- 关键词：AFGF腺病毒体外诱导血管新生缺血性心脏病
- 腺病毒介导的血管内皮生长因子体外靶向性转染心肌细胞被引量：1
- 2004年
- 目的 :构建以鼠心肌轻链蛋白基因 (mlc- 2 v)为启动子、携带人血管内皮生长因子 h VEGF1 6 5基因的重组腺病毒载体 ,检测该重组腺病毒载体对心肌细胞转染的靶向性。 方法 :酶切腺病毒载体 PDC31 5自身启动子 CMV,构建腺病毒载体PDC31 7,分别接入 h VEGF1 6 5、mlc- 2 v基因 ,构建腺病毒载体 PDC- mlc- h VEGF1 6 5。鉴定正确后 ,将 PDC- mlc- h VEGF1 6 5与 L ipo-fectam ine共转染至 2 93细胞 ,经同源重组获得以 m lc- 2 v为启动子、携带 h VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 Ad- m lc- h VEGF1 6 5,同步构建无靶向性的重组腺病毒 Ad- h VEGF1 6 5。扩增并测定滴度后 ,Ad- h VEGF1 6 5、Ad- mlc- h VEGF1 6 5分别转染体外培养的心肌细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞 ,利用 EL ISA、Western印迹分析等方法检测 Ad- mlc- h VEGF1 6 5转染心肌细胞的靶向性。 结果 :构建的病毒正确 ,病毒滴度为 2 .8× 1 0 9pfu/ ml。转染 3d后 ,Ad- h VEGF1 6 5组在各培养细胞的上清液及细胞内均检测到 VEGF的表达 ,而 Ad- mlc- h VEGF1 6 5组仅在心肌细胞中有 VEGF的表达 ,且 Ad- m lc- h VEGF1 6 5组心肌细胞分泌的 VEGF要少于 Ad-h VEGF1 6 5组。结论 :成功构建了以 mlc- 2 v为启动子、携带人 VEGF基因的重组腺病毒 Ad- m lc-
- 张裕东张宝仁梅举陈兰英刘红黄盛东钱其军吴红平李林芳肖海波王晓伟
- 关键词：血管内皮生长因子转染腺病毒心肌细胞
- 实验动物心肌梗塞模型的建立和染色方法的改进被引量：6
- 2002年
- 介绍了如何建立可靠稳定的心肌梗塞动物模型。通过应用常规病理苏木素 伊红 (H .E)染色及改进的碱性复红 苦味酸 (HBFP)组织化学染色 ,结果表明 ,在建立实验动物心肌梗塞模型时 ,操作规范、及时取材制片、选用改进的染色液和染色时间流程 ,即可证明心肌梗塞的发生。
- 刘延玲蔡凯华唐昊
- 关键词：实验动物染色方法动物模型组织化学染色
