国家自然科学基金(30470030)
- 作品数：12 被引量：31H指数：4
- 相关作者：王天云昝玉玺张俊河王俐杨保胜更多>>
- 相关机构：新乡医学院郑州大学郑州铁路职业技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金河南省科技攻关计划河南省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 盐藻14-3-3蛋白基因原核表达条件的优化被引量：4
- 2007年
- 目的探讨盐藻14-3-3蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达的条件。方法通过改变诱导剂浓度和诱导时间,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同条件下14-3-3蛋白的表达情况。结果在诱导剂(IPTG)浓度为0.5 mmol.L-1的条件下诱导培养3 h其表达效率最高。结论盐藻14-3-3蛋白在pET原核表达系统中,0.5 mmol.L-1IPTG诱导3 h为其最适表达条件。
- 张俊河昝玉玺王天云杨保胜
- 关键词：原核表达
- 构建人csp-B核基质结合区克隆及其介导的反转录载体
- 2010年
- 背景:核基质结合区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列。大量实验表明,核基质结合区可以作为DNA复制的起始点或调控基因的转录,构建核基质结合区表达载体能提高外源基因表达水平,增强外源基因表达的稳定性及提高转化细胞稳定株的频率等。目的:通过克隆人基因组不同的核基质结合区片段,构建核基质结合区介导的包含氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的反转录病毒载体pLXSN-MAR,以探索核基质结合区对基因表达的影响。方法:开放性实验于2007-01/12在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成。自行构建含氯霉素乙酰转移酶报告基因的质粒PLXSN-CAT载体。TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNAMarker、限制性内切酶BamHⅠ、凝胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均购于大连TaKaRa公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以人基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增csp-B核基质结合区序列,克隆入反转录载体PLXSN-CAT中,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果与结论:聚合酶链反应扩增的特异性片段长度为931bp,以此构建的重组质粒命名为PLXSN-CAT-MAR,经BamHⅠ酶切后显示5.9kb和931bp左右的两条片段,测序结果与Gen-bank中的人csp-B核基质结合区(Genbank序列号M62716)序列一致,证明人核基质结合区片段已成功克隆到了反转录载体PLXSN-CAT中。提示成功构建了PLXSN-CAT-MAR反转录表达载体。
- 昝玉玺王俐张俊河王天云
- 关键词：核基质结合区基因克隆
- 核基质结合区提高报告基因在稳定转化的杜氏盐藻中的表达被引量：7
- 2007年
- 前期的研究从杜氏盐藻(Dunaliella salina)中分离出一核基质结合区(matrix attachment region,MAR)片段---DSM1.实验证实,它在体外能与核基质结合且具有MAR的典型特征.为研究其在转基因盐藻中的作用,构建了RbcS启动子驱动、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因为报告基因及表达盒两侧含DSM1MAR的表达载体.电击法转化盐藻,随机挑选20株稳定转化的盐藻藻株,分析CAT酶活性.结果表明,在稳定转化的盐藻细胞中,MAR能使报告基因CAT的表达水平比对照藻株提高1.5倍,不同藻株之间个体表达的差异性也有所降低.
- 王天云薛乐勋姬祥王亚峰
- 关键词：核基质结合区基因沉默杜氏盐藻
- MAR结合蛋白及其调控功能被引量：4
- 2008年
- 核基质结合区(MAR)是真核生物中能与核基质结合的DNA片段.MAR通过与特异的MAR结合蛋白相互作用,在提高转基因表达水平、降低转基因个体之间表达水平差异以及染色体包装等方面具有重要的调控作用.目前,已在不同物种分离MAR结合蛋白,分别为核基质成分、核仁蛋白、组蛋白、叶绿体蛋白等,它们在调控基因表达、细胞发育、细胞凋亡、染色体包装等方面具有重要的功能.本文综述了目前分离出的MAR结合蛋白及其功能,并对MAR-结合蛋白研究作一展望.
- 王天云张俊河张煜王俐
- 关键词：核基质结合区核基质
- CHO细胞MAR片段的克隆及其逆转录载体的构建被引量：1
- 2009年
- 目的构建重组人促红素(CHO)细胞核基质结合区MAR的逆转录载体。方法以CHO细胞DNA为模板,采用PCR扩增CHO细胞的MAR序列,克隆入逆转录表达载体PLXSN-CAT中,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCR扩增的特异性片段长度为476 bp,以此构建的重组质粒PLXSN-CAT-MAR经BamHⅠ酶切后显示为5.9 kb和476 bp左右的两条片段,测序结果与Gen-bank中的CHO细胞MAR基因(Genbank序列号M62716)序列一致。结论成功构建了CHO细胞MAR片段PLXSN-CAT-MAR重组逆转录表达载体。
- 昝玉玺张俊河王天云
- 关键词：核基质结合区基因克隆
- 核基质结合区的位置对转基因表达的影响被引量：3
- 2009年
- 为研究核基质结合区(MAR)序列不同插入位置对转基因表达作用的影响,PCR扩增人β-珠蛋白MAR分别插入到含氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)报告基因真核表达载体pCATG表达盒两侧、5′端及3′端.酶切鉴定后,用阳离子聚合物转染CHO细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,ELISA分析CAT基因的表达水平,半定量PCR分析CAT基因相对拷贝数.结果表明,表达盒两侧含MAR序列的载体能提高介导的转基因表达水平平均提高10.4倍,5′端含MAR序列的载体表达水平平均提高3.9倍,3′端含MAR序列的载体反而降低转基因表达水平.5′端含MAR序列的表达载体其转基因相对拷贝数高于其它两组载体的基因拷贝数,转基因表达量与基因拷贝数不成正比.
- 张俊河昝玉玺王天云
- 关键词：核基质结合区转基因表达报告基因
- 杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的细胞定位被引量：2
- 2009年
- 为研究核基质结合区结合蛋白的功能及调控机制,PCR扩增杜氏盐藻MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列,与绿色荧光蛋白基因融合构建真核表达载体,脂质体转染CHO细胞,Western blotting和荧光显微镜检测基因表达情况和细胞定位。结果显示:MBP及N端和C端融合蛋白成功在CHO细胞表达,MBP和C端部分定位于细胞核且聚集于核仁,N端部分分布整个细胞,说明MBP定位于细胞核且细胞定位信号位于C端,MBP可能与rRNA前体结合发挥作用。
- 王鹏举王天云冯英才刘红涛薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻核基质附着区真核表达载体细胞定位
- 人β-干扰素核基质附着区在CHO细胞中对转基因表达的调控被引量：5
- 2008年
- 背景:核基质附着区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列,不仅可影响邻近内源基因的表达,还能克服转基因沉默,提高外源基因的转录与表达。目的:探讨在CHO细胞中β-干扰素核基质附着区对氯霉素乙酰转移酶转基因表达的影响。设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2007-04在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成。材料:CHO细胞株由中国典型培养物保藏中心提供。含氯霉素乙酰转移酶报告基因及G418筛选标记的质粒pCATG载体由本实验室构建。方法:将PCR扩增得到的人β-干扰素核基质附着区分别用SacI/KpnI及BamHI/SalI酶切,连接至用相应内切酶酶切的pCATG载体上,转化E.coliJM109,提取质粒行酶切电泳,将构建好的载体命名为pCAT-MAR,该载体含氯霉素乙酰转移酶报告基因表达盒及两侧的β-干扰素核基质附着区。分别用载体pCATG及pCAT-MAR转化CHO细胞,提取具有G418抗性的细胞株基因组DNA,PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因。主要观察指标:ELISA法分析氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达。PCR法检测pCAT-MAR载体是否稳定整合在宿主基因组上。结果:①pCATG转化的CHO细胞共筛选出16个阳性细胞株,pCAT-MAR转化的CHO细胞筛选出17个阳性细胞株。β-干扰素核基质附着区可使氯霉素乙酰转移酶报告基因表达水平提高2.8倍,pCATG转化CHO细胞的变异系数为2.0650,pCAT-MAR转化CHO细胞的变异系数仅为0.8131。②稳定转化的细胞株基因组DNA均扩增出437bp目的片段,证明pCAT-MAR载体已经稳定整合到基因组上。结论:β-干扰素核基质附着区能提高转基因在CHO细胞的表达水平,并且可降低不同转化细胞株之间转基因表达的差异性。
- 昝玉玺王天云张俊河王俐
- 关键词：核基质结合区基因沉默报告基因
- 重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化
- 2008年
- 根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体.抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.
- 王天云昝玉玺张俊河张煜王俐郭丽
- 关键词：杜氏盐藻原核表达
- 人珠蛋白MAR序列的克隆与表达载体pCAT-MAR的构建被引量：4
- 2006年
- 目的克隆人β-珠蛋白核基质结合区(matrix attachment regions,MAR),构建包含MAR及报告基因CAT的哺乳动物载体pCAT-MAR。方法酚/氯仿抽提、乙醇沉淀提取人基因组DNA,根据GenBank报道的序列设计引物PCR扩增人β-MAR,琼脂糖凝胶电泳鉴定,测序,软件分析其序列特征。限制酶酶切,连接至pCAT3-control载体上构建pCAT-MAR载体。结果琼脂糖凝胶电泳PCR扩增出770bp条带,序列和报道的序列相似性为99.9%,克隆的DNA片段具备典型的MAR特征。酶切及琼脂糖凝胶电泳证明所构建的pCAT-MAR载体正确。结论PCR克隆了人-β珠蛋白MAR序列,成功构建了包含MAR的表达载体pCAT-MAR。
- 王天云张慧珍
- 关键词：核基质结合区基因沉默报告基因
