国家自然科学基金(30800410)
- 作品数：17 被引量：30H指数：4
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- 相关机构：重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室第三军医大学更多>>
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- 小脑症1基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响
- 2014年
- 目的探讨小脑症1(microcephalin 1,MCPH1)基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响。方法将质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染肺癌细胞株A549,并设阴性对照组[pcDNA3.1(-)质粒转染]和未转染组。转染48 h后,采用qRT-PCR法检测各组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测各组细胞中MCPH1蛋白的表达水平,流式细胞术分析细胞的凋亡情况。结果质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染A549细胞后,均可明显上调细胞中MCPH1基因mRNA和蛋白的表达,与阴性对照组和未转染组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染组细胞凋亡率[(16.82±1.29)%]较阴性对照组[(6.27±0.88)%]和未转染组[(5.36±0.43)%]明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 MCPH1过表达后可明显促进A549细胞的凋亡,为进一步研究MCPH1基因在肺癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。
- 张冀吴晓彬麦力袁成福刘革力易发平卜友泉宋方洲
- 关键词：基因表达肺癌A549细胞
- EGFP—pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定
- 2010年
- 目的构建表达增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）的EGFP—pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定。方法从pEGFP—N3质粒上切下EGFP片段，连接到pBABE载体，构建EGFP—pBABE重组质粒；将该重组质粒转染到Fr67细胞后，荧光显微镜下观察EGFP的表达；收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功构建EGFP—pBABE重组质粒。该质粒转染PT67细胞24h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达；用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36h后，在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达。结论成功构建表达EGFP的EGFP—pBABE逆转录病毒载体，为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础。
- 刘革力袁成福张路渝卜友泉易发平马永平宋方洲
- 关键词：逆转录病毒载体
- 用pLNCX2携带人MCPH1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定
- 2012年
- 目的建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌Caski细胞中对MCPH1表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX2中，构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pLNCX2-shRNA—MCPH1，经PT67细胞包装后，产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株Caski细胞，并用G418筛选产生稳定的细胞克隆，用RT—PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确，逆转录病毒感染Caski细胞后用G418筛选出稳定的细胞克隆，RT—PCR和Western印迹检测人MCPH1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MCPHI基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染Caski细胞后能明显抑制MCPHImRNA和蛋白表达，为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。
- 陈显兵刘锦红谭志鑫袁成福
- 关键词：逆转录病毒载体SHRNA宫颈癌
- 单羧酸转运蛋白过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响
- 2013年
- 目的研究单羧酸转运蛋白(MCT)过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法将真核表达质粒pcDNA3.1/MCT(实验组)及空质粒pcDNA3.1(阴性对照组)分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,将未处理的细胞作为空白对照组。采用Real-Time PCR和细胞免疫荧光化学法分别检测转染MCT基因的效率;采用MTS法检测转染MCT基因后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响,同时用吖啶橙染色法检测细胞形态学的改变;采用流式细胞仪检测过表达MCT基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、坏死和周期的影响;采用Transwell实验检测转染MCT基因后对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响。结果实验组MCT的基因和蛋白水平明显高于的阴性对照组和空白对照组(P<0.01);MCT基因过表达能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡和坏死,促使细胞周期S期上升和G2期下降,同时能抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力(P<0.01或P<0.05)。结论 MCT基因过表达能促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡和坏死,调控细胞周期,同时能抑制细胞的增殖、侵袭和转移能力。
- 马冬梅麦力吴晓彬汪长东余畅李海玉李韵黄裕兵宋方洲
- 人类小脑症基因1与基因组稳定性
- 2014年
- 人类小脑症基因1(Microcephalin 1,MCPH1)又叫人端粒酶逆转录酶抑制基因(BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression,BRIT1),它编码一个110 kD的含有835个氨基酸的核结合DNA损伤应答蛋白,能与癌症相关基因蛋白(E2F、p53、BRCA1/2等)、DNA损伤应答蛋白(ATM、ATR、RAD51和CondensinⅡ等)以及细胞周期调节蛋白(CDK1、cyclins)等多种重要蛋白相互作用,它能参与到细胞周期调控、DNA损伤修复以及抑制肿瘤发生发展等多种细胞活动中,在维持基因组稳定性方面起重要作用。本文对MCPH1的生化结构、维持基因组稳定性以及在人类肿瘤中所发挥的作用做一综述。
- 张冀袁成福宋方洲
- 关键词：DNA修复肿瘤抑制
- 索拉非尼诱导肝癌HepG2细胞自噬的机制及意义被引量：4
- 2013年
- 目的探讨索拉非尼诱导肝癌HepG2细胞自噬的机制及意义。方法用GFP-LC3质粒转染HepG2细胞后观察索拉非尼对自噬小体形成的影响;免疫共沉淀法检测索拉非尼对Mcl-1与Beclin1之间相互作用的影响;使用siRNA沉默自噬相关基因Atg5或用氯喹(CQ)抑制自噬后观察索拉非尼抗肝癌细胞的效应;Western blot检测自噬与凋亡相关蛋白Atg5、Beclin1、LC3、Mcl-1与PARP表达的变化。结果索拉非尼处理HepG2细胞后LC3-Ⅱ蛋白表达量呈剂量依赖性增强,索拉非尼处理后转染GFP-LC3的HepG2细胞中出现明显的自噬小体样点状荧光,Western blot结果显示索拉非尼处理后HepG2细胞中Mcl-1表达下调,Beclin1无明显变化,Co-IP证实在HepG2细胞中Mcl-1和Beclin1间存在蛋白相互作用,索拉非尼能减弱Mcl-1和Beclin1的结合。抑制自噬后能明显增强索拉非尼的杀细胞效应。结论索拉非尼可能通过下调Mcl-1来诱导肝癌HepG2细胞自噬,抑制自噬后可显著增强索拉非尼的杀细胞效应。
- 秦利燕王滨倪振洪连继勤宋方洲袁成福刘革力
- 关键词：索拉非尼自噬MCL-1
- 人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法:将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSi RNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSi RNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。
- 袁成福程莉黄秀凝卜友泉刘革力宋方洲
- 关键词：RNA干扰逆转录病毒载体宫颈肿瘤
- MCPH1在肺组织的表达及其对人肺癌细胞株H1299凋亡的影响被引量：6
- 2014年
- 目的探讨MCPH1基因在肺癌组织和正常组织的蛋白表达分布及其过表达后对人肺腺癌细胞系H1299凋亡的影响。方法临床收集20例肺癌组织和8例正常肺组织标本,免疫组化法检测MCPH1蛋白在肺组织的表达分布,真核表达质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1和空白质粒pcDNA3.1瞬时转染肺癌细胞株H1299,并设立未处理组。转染质粒48 h后,采用Real-time PCR法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录表达情况;转染72 h后提取细胞总蛋白,Western blot检测细胞中MCPH1蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡。结果 MCPH1蛋白在肺癌组织中表达低于正常组织,而且MCPH1蛋白在癌组织中表现为核质低表达,在正常组织中为核质高表达;H1299转染pcDNA3.1(-)/MCPH1重组质粒后,可有效上调H1299细胞中MCPH1基因的mRNA和蛋白表达,处理组的细胞凋亡率(18.10±1.87)%较pcDNA3.1(-)转染组(5.76±1.85)%和未处理组(5.85±0.57)%显著增加(P<0.05)。结论 MCPH1在人肺癌组织表达降低,过表达之后可诱导肺腺癌细胞发生凋亡。
- 张冀麦力吴晓彬肖明袁成福卜友泉宋方洲
- 关键词：肺癌免疫组化H1299
- MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定
- 2009年
- 目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体，并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响，为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA，并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA；在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，感染表达MKRN1的HeLa细胞株，用RT-PCR法及Western印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响，用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果成功构建了MKRN1的siR-NA重组腺病毒载体；MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达，并显著上调细胞中端粒酶的活性。结论构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性，从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具。
- 石艳艳刘涛张琴袁成福卜友泉易发平刘革力宋方洲
- 关键词：腺病毒载体RNA干扰端粒酶HELA细胞
- 单羧酸转运蛋白基因过表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞生物学行为的影响被引量：1
- 2014年
- 目的研究单羧酸转运蛋白(MCT)基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期、侵袭和转移能力的影响。方法将真核表达质粒pcDNA3.1/MCT及空质粒pcDNA3.1分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。采用实时定量PCR(qRTPCR)和Western blot法分别检测转染后细胞内MCT基因的表达。Annexin V-FITC/PI染色和PI单染色结合流式细胞术检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期的影响,Transwell实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响,划痕实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。结果实验组MCT的mRNA和蛋白水平明显高于转染空质粒的阴性对照组和未处理组;MCT过表达能促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡,G2期细胞减少、S期细胞增多,同时能抑制癌细胞的侵袭和迁移能力。结论 MCT基因过表达能促进MDA-MB-231细胞的凋亡、调节细胞G2/M期检控点,抑制细胞的侵袭和迁移能力。
- 马冬梅麦力吴晓彬汪长东余畅李海玉李韵高月宋方洲
- 关键词：MCTMDA-MB-231凋亡周期
