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沼泽型水牛CYP19A1基因克隆、序列分析及组织表达研究被引量：13: 2013年; 旨在对沼泽型水牛CYP19A1基因进行克隆、生物信息学分析及对其在水牛组织的表达规律进行系统的探索。根据GenBank已公布的牛CYP19A1基因序列,设计特异性引物应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,分析和预测了水牛CYP19A1的理化性质、蛋白质二级及三级结构;应用QRT-PCR技术对CYP19A1在水牛组织的表达进行了差异分析。测序结果表明:水牛CYP19A1基因的编码区全长1 512bp,共编码503个氨基酸。多重序列比较分析显示水牛CYP19A1核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人、马相应序列相似性分别为99%、98%、91%、86%和84%,结合系统进化树分析结果推测,CYP19A1基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。定量分析结果显示:水牛CYP19A1在水牛垂体、大脑、肝脏、骨骼、卵巢、肌肉和心脏组织具有不同程度的表达,其中垂体和大脑表达量最高,骨骼和卵巢次之,肌肉表达最低。本研究成功地克隆了沼泽型水牛CYP19A1基因并研究了其在不同水牛组织中的表达规律,为阐明其在水牛性腺中参与的激素合成转化规律等研究奠定了理论基础。; 苏节刘庆友朱鹏沈开元石德顺崔奎青; 关键词：水牛克隆分析

动物手工克隆技术研究进展被引量：1: 2014年; 动物克隆又称动物无性繁殖技术是动物辅助生殖技术研究领域跨时代的进步,在优秀动物个体复制、濒危动物保护以及细胞分化研究中应用广泛。近年来出现的动物手工克隆技术(handmade cloning,HMC)是应用无透明带去核双半卵进行动物克隆的新方法,HMC技术脱离了昂贵的显微操作系统做到全程手工操作。手工克隆技术的应用大大大简化了核移植的操作程序,提高了核移植的总体效率,核移植向畜牧生产转化又迈进了一大步。作者对手工克隆技术的研究进展,操作程序以及影响手工克隆效率的因素等方面进行了系统综述,并对HMC未来发展进行了展望。; 吕玲燕刘庆友谢炳坤石德顺; 关键词：动物核移植

甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理对德保猪手工克隆胚胎体外发育潜能的影响被引量：3: 2014年; 供体细胞的不完全重编程是动物克隆效率低的主要原因。本研究采用不同浓度(0.00(对照)、0.25、0.50和1.00μmol·L^(-1))的DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理德保猪耳成纤维细胞,将处理后成纤维细胞作供体进行手工克隆。结果显示:各处理组细胞生长曲线均呈"S"型,其中0.25μmol·L^(-1)组细胞生长曲线与对照组最相近。随着5-Aza-CdR浓度增加,细胞均有不同程度的畸变、生长抑制甚至致死。0.00~0.50μmol·L^(-1)5-Aza-CdR处理对德保猪成纤维细胞不会显著改变其细胞染色体整倍性。5-Aza-CdR不同程度下调了德保猪耳成纤维细胞中Dnmtl、Tet1、Tet2和Tet3的相对表达,对Dnmt1、Tet1和Tet3表达量的下调呈剂量相关。以处理后成纤维细胞作供体,猪手工克隆重构胚体外发育的卵裂率(24、48 h)和桑椹胚率各组间差异不显著(P>0.05),其中0.25μmol·L^(-1)组和0.50μmol·L^(-1)组囊胚发育率显著高于1.00μmol·L^(-1)组(P<0.05),而与对照组差异不显著(P>0.05)。0.50μmol·L^(-1)组囊胚细胞数显著高于对照组和1.00μmol·L^(-1)组(P<0.05),而与0.25μmol·L^(-1)组之间差异不显著(P>0.05)。综上表明:高浓度5-Aza-CdR对德保猪成纤维细胞增殖和染色体具有副作用,低浓度(≤0.25μmol·L^(-1))的5-Aza-CdR可用于供体处理以降低克隆胚胎甲基化水平及提高手工克隆猪胚胎发育潜能。; 陆杏蓉孙俊铭李志鹏李兰玉谢炳坤刘庆友石德顺崔奎青; 关键词：5-AZA-CDR 重编程

水牛ALK5基因克隆分析与组织表达模式研究被引量：1: 2015年; 为了阐明水牛ALK5基因在水牛卵泡发生过程中的作用,了解其在水牛不同组织中的表达模式,试验采用了RT-PCR及QRT-PCR方法对ALK5基因进行了研究,参考已公布的Gen Bank中牛ALK5基因序列,设计特异性引物应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析和预测了水牛ALK5基因的遗传进化、蛋白质的理化性质、二级和三级结构,并应用QRT-PCR技术对ALK5基因在水牛组织的表达进行了差异分析。结果表明:水牛ALK5基因的编码区全长为1 512 bp,共编码503个氨基酸;水牛ALK5核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、97%、95%、93%和90%,结合系统进化树分析结果推测ALK5基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性;该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在low complexity和GS结构,呈典型跨膜蛋白结构;水牛ALK5基因在肺脏、垂体、下丘脑组织中不表达,在水牛大脑、肝脏、骨骼、卵巢、肌肉和心脏等12个组织细胞中具有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低。说明试验成功地克隆了沼泽型水牛ALK5基因,其具备典型的TGF-β受体家族结构,表达具有一定的组织特异性。; 朱鹏赵鲜红粟小平苏节刘金凤刘庆友石德顺; 关键词：水牛克隆分析

增殖细胞核抗原在水牛腔前卵泡中的表达与卵巢组织定位: 2013年; 【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原(PCNA)参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示:原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示:PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异(43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219,P<0.01);【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。; 马帆周宇高亚可朱鹏雷小灿刘庆友石德顺; 关键词：水牛 PCNA

猪手工克隆重构胚胎发育效果影响的最佳VPA浓度初探被引量：1: 2016年; 为了探讨丙戊酸(VPA)对手工克隆(HMC)重构胚胎发育效果影响的最佳浓度,本研究比较了mmol/L级别和nmol/L级别两种浓度的VPA持续地处理猪HMC重构胚24 h的发育效果。试验结果表明:两种级别的VPA对猪HMC重构胚胎发育的卵裂率的影响差异不显著(p<0.05),就囊胚率和囊胚细胞数而言,mmol/L级别的VPA浓度抑制其发育,且随着浓度的升高,抑制作用表现明显。nmol/L级别的VPA浓度能促进其发育,且50 nmol/L的VPA为最佳浓度,囊胚率为44.28%,细胞数为72.33个,显著高于其他浓度处理组(p<0.05)。因此,应用50 nmol/L的VPA处理可提高猪HMC重构胚胎的囊胚率及增加囊胚细胞数,提高了猪HMC胚胎的体外发育潜能。; 吕玲燕吴永绍陈宝剑汪燕玲马青艳农素群谢炳坤潘天彪; 关键词：VPA

猪无透明带卵母细胞孤雌激活培养体系的优化: 2015年; 为了探讨猪无透明带卵母细胞孤雌激活培养体系,为手工克隆法生产小猪奠定理论和实验基础,本研究比较了不同浓度链霉蛋白酶对猪卵母细胞透明带的消化率及后期发育的卵裂率;比较了不同电激活参数对无透明带卵母细胞激活效率的影响,并探索了最适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小。结果表明:2 mg/m L链霉蛋白酶能得到最高的消化率及后期发育的卵裂率;最佳电激活参数为:70 V/mm电压,80滋s脉冲时间,2次脉冲;较适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小为:底部直径约为l20μm,深度约为150μm。; 吕玲燕孙俊铭陆杏蓉潘翠玲关志惠潘天彪谢炳坤; 关键词：孤雌激活

高分辨率熔解曲线HRM在SNP检测中的应用被引量：10: 2015年; 自然界生物具有丰富多样性,其本质在于DNA序列的多样性,单核苷酸多态性(SNP)是DNA序列多样性的基本单位,亦为生物进化和选择的动力源。越来越多的研究表明,SNP与人类的疾病、动植物的生长性状显著相关,对SNP的检测亦逐渐成为疾病检测和生物分子育种的重要手段。与传统的SNP检测技术相比较,高分辨率熔解曲线(HRM)具有高通量、高灵敏度、高特异性、快速、操作简单和重复性好的特点,能够快捷、有效筛查生物群体中的SNP位点,将逐渐成为SNP检测的主流技术。本文对HRM原理、方法、特点和应用进行综述,以飨读者。; 王冬梅李俊杨红敏石德顺刘庆友; 关键词：单核苷酸多态性

沼泽型水牛ALK3基因克隆分析与表达模式研究被引量：4: 2015年; 试验旨在对沼泽型水牛ALK3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在水牛组织中的表达规律进行系统研究。根据GenBank中已公布的牛ALK3基因序列设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增、克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法分析和预测了水牛ALK3的遗传进化及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用QRT-PCR技术对ALK3基因在水牛组织中的表达进行了差异分析。结果表明,水牛ALK3基因编码区全长1 599bp,共编码532个氨基酸。多重序列比较分析显示,水牛ALK3核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、人和小鼠相应序列的同源性分别为98%、96%、95%、93%、94%和91%。系统进化树分析显示,ALK3基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对ALK3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在丝氨酸/苏氨酸激酶和GS等结构。定量分析结果显示,ALK3在水牛生殖脊、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑等15种组织或细胞中有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,垂体、肺脏和睾丸次之,卵丘细胞表达量最低。本研究成功克隆了沼泽型水牛ALK3基因,并研究了其在不同水牛组织细胞中的表达规律,为阐明其在水牛繁殖过程中的功能及转基因载体构建中的应用研究奠定了理论基础。; 朱鹏粟小平苏节刘金凤刘庆友石德顺; 关键词：水牛克隆分析

猪卵母细胞电激活方法初探: 2012年; 本实验比较了已报道的4组常用的猪卵母细胞电激活方法,并对电激活参数进行系统探索。结果表明:电激活参数(125 V/mm,80μs,1 DC),激活液0.3 mol/L甘露醇+0.1 mmol/L MgSO4+0.1 mmmol/L CaCl2+0.01%PVA的激活方案,囊胚发育率显著优于其他3组方案(25.6%vs 12.6%vs 21.5%vs 15.2,P<0.05);脉冲电压100 V/mm时3次脉冲激活组囊胚发育率优于2次和1次脉冲组(27.3%vs 16.2%vs 21.7%,P<0.05);激活液中Ca2+浓度(0.1%,0.05%)对激活效果无显著影响,囊胚发育率分别为36.5%和40.9%;本实验结果中电激活效果明显优于化学激活(46.3%vs 29.4%,P<0.05)。通过上述实验本研究建立了一种优化的猪卵母细胞电激活方法,为生产单精子显微注射与体细胞核移植猪奠定了基础。; 刘帅吕玲燕孙俊铭刘庆友石德顺崔奎青; 关键词：卵母细胞电激活

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