国家高技术研究发展计划(2011AA10A200)
- 作品数：25 被引量：96H指数：5
- 相关作者：刘光清李传峰陈宗艳孟春春王超更多>>
- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所安徽农业大学甘肃农业大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用被引量：7
- 2014年
- 虽然H3、H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是低致病性禽流感病毒，但其具有跨宿主感染哺乳动物的能力，对社会公共卫生安全具有重大的潜在危害，因而对这些亚型病毒的监测极其重要。通过比对GenBank上H3、H9亚型禽流感病毒HA基因序列，设计了分别针对H3 AIV和H9 AIV的特异性探针。特异性试验和标准曲线试验的结果显示，这两个探针仅分别特异性识别H3、H9亚型AIV，且具有较好的扩增效率。通过重组质粒pMD19-T-H3HA和pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板，进行敏感性实验。结果表明，本研究所建立的荧光定量PCR方法能检测到100个DNA拷贝数H3 AIV和10个DNA拷贝数的H9 AIV，比传统PCR方法敏感性分别提高了100倍和1000倍。此外，本方法还能检测到10 EID50的H3亚型AIV或H9亚型AIV，比传统PCR方法检测敏感性均提高了1000倍。批间和批内试验的变异系数均小于3%，表明本研究建立的方法具有较好的重复性。此外，与传统PCR方法相比，用H3、H9亚型AIV双重荧光定量PCR方法检测人工感染动物的肺组织时，针对H3 AIV的敏感性提高了10~100倍，针对H9 AIV的敏感性提高了100倍。综上所述，本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有较高的特异性和敏感性，对H3、H9亚型禽流感病毒监测具有重要的应用价值。
- 申伟霞田巧珍陈圆胡涛闫丽萍李国新李雪松滕巧泱赵宇军李泽君
- 关键词：H3H9禽流感病毒
- H9N2亚型禽流感病毒细胞灭活疫苗的免疫效果评价被引量：3
- 2012年
- 由于经济和技术因素的制约,尚未有成功的禽流感细胞疫苗产品上市。为此,本研究在细胞扩增而来的含有H9亚型禽流感病毒(AIV)HA和NA基因的SH441HANAPR8(NS mutant)重组病毒里加入终浓度为0.1%的甲醛进行灭活。结果显示,37℃条件下灭活24h的效果最佳。灭活好的H9AIV SH441HANAPR8(NS mutant)与佐剂MontanideISA70VG乳化制备成灭活苗,以0.05、0.1、0.2、0.3mL/只的剂量,分别胸部肌肉注射免疫3周龄的SPF鸡,并于免疫后21d静脉感染A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)AIV。结果显示,该疫苗的最小免疫剂量为0.2mL。此外,研究还发现,当HI抗体效价≥25时,疫苗对鸡只的攻毒保护率达到100%。
- 刘建龙滕巧泱范钊胡涛李雪松李国新葛铭李泽君
- 关键词：H9N2亚型禽流感病毒最小免疫剂量免疫
- 鸭肝炎病毒1型“自杀性”DNA疫苗的构建及其免疫评价
- 目的:构建Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的自杀性DNA疫苗,探索其在细胞中的表达和对雏鸭的免疫保护效果。方法:将鸭肝炎VP1基因插入甲病毒复制子载体pSCA1载体中,获得重组表达质粒pSCA1/VP1。将该质粒转染BHK-21...
- 付玉志李传峰陈宗艳刘光清
- 关键词：VP1基因ELISA
- 文献传递
- Vpg在单股正链RNA病毒生命活动中的作用被引量：1
- 2013年
- 在多种动、植物单股正链RNA病毒基因组的5'末端往往共价结合一个小分子Vpg蛋白,它可以与多种病毒蛋白或宿主细胞因子相互作用,并形成复合物,参与了病毒的翻译、复制或致病等基本生命活动,研究该蛋白的结构与功能对于阐述单股正链RNA病毒的生命本质具有重要意义,本文对近年来的相关研究进展进行了概括介绍。
- 刘光清
- 关键词：VPG单股正链RNA病毒
- 新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备被引量：6
- 2014年
- 为了解新型鸭呼肠孤病毒(NDRV TH11株)σC蛋白的抗原性,采用RT-PCR方法扩增了NDRV TH11株σC蛋白的编码基因,将其克隆于原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-σC重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析表明该重组蛋白获得高效表达,并具有较好的反应原性。以纯化的σC蛋白免疫实验兔制备了抗σC蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1∶20 000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别NDRV的σC蛋白,显示出σC蛋白具有良好的免疫原性。
- 毕庄莉朱英奇陈宗艳李传峰孟春春王桂军刘光清
- 关键词：新型鸭呼肠孤病毒原核表达多克隆抗体
- 鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备被引量：9
- 2012年
- 本试验利用纯化的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus , DTMUV)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,筛选获得3株能够稳定分泌杭DTMUV的杂交瘤细胞,分别命名为:J1-E5-E4, 7B5和1E5-B6,3株杂交瘤细胞诱导同品系刁、鼠的杭体效价为1:12 800,1:6 400和1:25 600。间接ELISA和IFA结果显示,3株单杭均可以与DTMUV发生特异性反应。进一步研究发现,J1-E5-E4可以与DTMUV-E蛋白结合,使得表达E蛋白的293T细胞显现出特异性的绿色荧光;在病毒中和试验中,J1-E5-E4可以中和DTMUV,使其失去致死鸡胚的能力。这些结果表明,J1-E5-E4是一株针对DTMUV-E蛋白中和表位的单杭,该单杭将在DTMUV诊断和杭原分析中发挥重要作用。
- 姬希文李雪松李国新肖亚莉颜丕熙徐大伟范钊张七斤李泽君
- 关键词：E蛋白单克隆抗体
- 新发鸭源呼肠孤病毒（TH11株）的分离与鉴定
- 本文从太湖流域某养鸭场分离到一株呼肠孤病毒（DRV TH11株）,该病毒感染的病鸭主要表现软脚和拉稀等主要症状,剖检病变以肝脏出血和脾脏坏死为主要特征。电镜鉴定结果显示,该病原具有呼肠孤病毒的典型形态学特征。动物回归试验...
- 陈宗艳朱英奇李传峰李露付玉志王超刘光清
- 关键词：呼肠孤病毒动物回归试验电镜RT-PCR
- 文献传递
- 鸭源呼肠孤病毒Sigma A蛋白的原核表达及免疫活性检测被引量：2
- 2013年
- 为制备新型鸭源呼肠孤病毒(DRV)TH11株Sigma A蛋白的多克隆抗体,本研究采用RT-PCR方法扩增DRV TH11株Sigma A的编码基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。采用SDS-PAGE和western blot对表达产物进行鉴定。结果表明,Sigma A基因不仅可以在大肠杆菌中高水平表达,表达产物的分子量约66 ku,而且表达产物能够被特异性DRV多克隆抗体识别,证明表达的Sigma A蛋白具有良好的免疫活性。以纯化的Sigma A蛋白免疫实验兔制备抗Sigma A蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1∶20 000以上。间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别DRV的Sigma A蛋白,表明Sigma A蛋白具有良好的免疫原性。本研究为进一步研究Sigma A蛋白的功能,以及建立DRV检测方法奠定了基础。
- 朱英奇陈宗艳李传峰孟春春王桂军刘光清
- 关键词：SIGMAA基因原核表达
- 鸭甲肝病毒GX株全基因组序列测定及VP1蛋白生物信息学分析被引量：2
- 2015年
- 为探讨鸭甲肝病毒(DHAV)GX株基因分型特点及主要衣壳蛋白(VP1)的生物学特性,本试验对其进行全基因组序列测定,并应用分子生物学软件将DHAV GX株与DHAV 3个血清型参考毒株进行序列比对分析。结果显示,其基因组全长7 800bp,由5′和3′非编码区(UTR)和一个大开放阅读框(ORF)组成。其中,5′UTR和3′UTR的长度分别为652和369bp;ORF长度为6 756bp,编码2 251个氨基酸长的多聚蛋白,其编码产物至少有12个(VP0/VP3/VP1/2A1/2A2/2A3/2B/2C/3A/3B/3C/3D);在分类地位上DHAV GX株属于DHAV-3,其与DHAV-3参考株核苷酸、氨基酸同源性最高;与DHAV-3FS株亲缘关系最近,在同一较小分支上。DHAV GX株结构蛋白VP1以第195—201、211—221位氨基酸区段为B细胞优势表位的可能性较大。提示,VP1基因可作为研制DHAV基因工程疫苗的优势候选基因。
- 黄云秀李传峰孟春春陈宗艳李露宋凯杰刘光清韦天超
- 关键词：全基因组VP1蛋白B细胞抗原表位
- 鸡J亚群禽白血病病毒AH-J11株的全基因组感染性克隆构建
- 2013年
- 为探究鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的致病机理,采用PCR方法分4段分别扩增出J亚群禽白血病病毒安徽分离株AH-J11的前病毒cDNA,PCR产物经克隆鉴定,酶切后顺次连接,获得含有完整ALV-J AH-J11株前病毒cDNA的重组质粒,命名为pSK-AH-J11。将AH-J11株全基因序列克隆至pBluescriptⅡSK(+)载体中,得到重组质粒pBl-AH-J11,并将其转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。通过间接免疫荧光试验,RT-PCR和Western blot检测,并经测序验证比对拯救前后病毒的gp85基因序列,结果均表明拯救出了1株重组J亚群禽白血病病毒(rALV-J)。本研究成功构建了鸡ALV-J的感染性克隆并救获了其重组病毒,为研究禽白血病的致病机理提供了良好的反向遗传操作技术平台。
- 王蓓刘芳王汉清李宁魏建忠刘光清王桂军
- 关键词：J亚群禽白血病病毒全基因组感染性克隆病毒拯救
