辽宁省自然科学基金(20032142)
- 作品数：9 被引量：38H指数：4
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- 相关机构：锦州医学院辽宁医学院内蒙古医学院第三附属医院更多>>
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- 不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较被引量：2
- 2010年
- 目的探讨分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的最佳胚龄。方法分别从孕3.5 d和4.5 d的母鼠子宫中分离收集桑椹胚和囊胚,比较体外培养时胚胎的贴壁率、内细胞团(inner cell mass,ICM)形成率、形成ES细胞克隆率(P1)和形成ES细胞亚克隆率(P2)。结果孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚,分离培养结果表明,后者的胚胎贴壁率、ICM形成率和ES细胞克隆形成率均高于前者,均有显著性差异(P<0.05)。结论囊胚较桑葚胚更适合作为体外分离培养昆明小鼠ES细胞的材料。
- 秦书俭张海锋单伟
- 关键词：昆明小鼠胚胎干细胞胚龄
- β-巯基乙醇诱导大鼠骨髓基质细胞神经细胞蛋白的表达
- 2007年
- 目的:骨髓基质细胞具有向神经细胞分化的能力,观察化学诱导剂β-巯基乙醇体外诱导大鼠骨髓基质细胞后神经细胞标志蛋白的表达率。方法:实验于2006-09-01/2006-10-20在辽宁医学院中心实验室完成。①实验材料:选取清洁级2月龄SD大鼠12只,由辽宁医学院实验动物中心提供,体质量200g左右,雌雄不拘。②实验方法:采用贴壁培养与传代的方法分离纯化SD大鼠骨髓基质细胞,将第2代细胞置于含有4mol/Lβ-巯基乙醇诱导剂的培养基中诱导6h。③实验评估:应用倒置显微镜观察骨髓基质细胞与诱导后细胞形态,采用免疫组织化学法检测巢蛋白,胶质纤维酸性蛋白,神经丝蛋白的表达率。结果:诱导前大鼠骨髓基质细胞以长梭形细胞为主,诱导后可见细胞体积缩小,胞体伸出较多突起并有分枝出现,个别细胞形态类似神经细胞。诱导6h后,细胞中巢蛋白、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白均有表达,表现为胞浆呈棕黄色,免疫组织化学检测神经细胞标志蛋白神巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白表达率分别为85.12%,6.56%,80.17%。结论:大鼠骨髓基质细胞体外分离纯化方法简单易行,在β-巯基乙醇诱导下,较高的表达了神经细胞标志物。
- 马云胜罗美秦书俭穆长征
- 关键词：骨髓基质细胞
- 体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞最佳胚龄的筛选:孕2.5d与3.5d及4.5d比较被引量：2
- 2010年
- 背景:昆明小鼠基因型与人类近似,建立昆明小鼠胚胎干细胞系有利于其转基因动物的获得,但目前对于何时收集胚胎尚无明确报道。目的:探讨体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的最佳胚龄。方法:分别从孕2.5d,3.5d和4.5d的昆明系母鼠子宫中分离收集胚胎,于显微镜下观察胚胎的形态、贴壁情况、内细胞团形成情况、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率等,并进行碱性磷酸酶染色。结果与结论:孕2.5d采集的胚胎多为16细胞期胚胎,孕3.5d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5d采集的胚胎多为囊胚。孕2.5d胚胎和孕3.5d胚胎的贴壁率、内细胞团形成率、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率均无明显差异(P>0.05);孕4.5d胚胎上述指标均显著高于前两者,更适合作为胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代的材料。
- 张海锋单伟秦书俭
- 关键词：昆明小鼠胚龄内细胞团胚胎胚胎干细胞
- 枸杞多糖诱导大鼠骨髓间充质细胞向神经元样细胞转化的实验研究被引量：12
- 2006年
- ①目的探讨枸杞多糖诱导骨髓间充质细胞(BMSCs)向神经细胞转化的可能机制。②方法用贴壁筛选法分离培养出贴壁生长良好的骨髓BMSCs。选取第3代细胞,当传代细胞长满瓶底的80%以上时,先用含15%FBS和1g/L枸杞多糖的DMEM培养基预诱导24小时,然后,用不含血清的1g/L枸杞多糖的DMEM培养基诱导。光镜下观察细胞形态;用免疫组化技术检测细胞Nes-tin、NF、GFAP的表达。③结果预诱导后,BMSCs没有变化。而经过枸杞多糖诱导后,细胞在4小时后即出现形态学上的改变,细胞变凸,立体感增强,从胞体伸出突起。免疫组化检测显示,细胞Nestin、NF染色阳性,GFAP阴性。④结论骨髓间充质细胞经过枸杞多糖的诱导可以转化为神经细胞。
- 刘树辉马云胜曹中伟秦书俭郑德宇
- 关键词：骨髓间充质细胞枸杞多糖神经细胞
- 大鼠脊髓半切损伤模型的制备被引量：8
- 2005年
- 目的用一种新的方法建立简便易行,稳定可靠的脊髓半切损伤模型.方法取45只SD大鼠随机分为3组:假手术组为A组5只,40只为手术组(其中20只用眼用手术尖刀通过T11～T12椎间隙切割脊髓一侧1/2制成hSCI模型为B组,另20只用有齿血管钳咬除T11-12棘突和1/2椎板,用显微剪在T13～L1节段脊髓剪断其一侧1/2制成hSCI模型为C组).术后不同时间观察脊髓组织学变化,并记录脊髓神经功能综合评分(CBS).结果光镜下伤侧灰质缩小,脊髓远端侧索和灰质神经变性坏死,出现大量空泡而神经元减少且明显萎缩,Waller's溃变下节段较上节段严重,术后CBS评分两两比较q检验发现手术组与假手术组有显著意义(P＜0.01),但B组与C组CBS评分无显著性差异(P＞0.05).结论用眼用手术尖刀切割和显微剪切割制成hSCI模型具有同样的模型效果,但前者制备的模型死亡率低,更简单易行、安全可靠等优点.
- 曹中伟刘树辉马云胜郑德宇秦书俭
- 关键词：疾病模型
- 神经干细胞移植修复大鼠脊髓半切伤的研究被引量：4
- 2006年
- 目的:观察神经干细胞移植修复脊髓半切伤的疗效并探讨移植最佳时机。方法:制备大鼠T13～L1脊髓半切伤模型,取胎龄13.5d胎鼠大脑组织,体外分离、培养、诱导神经干细胞,并采用免疫细胞化学技术分别检测NSC(neuralstemcell)特征性标志Nestin(巢蛋白)表达和用血清诱导分化为大量神经元NSE(neuronspecificenolas)和神经胶质细胞GFAP(glialfibrillaryacidicprotein)表达。用明胶海绵吸附BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶)标记好的神经干细胞悬液移植到脊髓半横断处,移植时间选择损伤后立即移植、损伤后第9、14d。观察移植后的大鼠行为的变化,通过CBS(combinebehavioralscore)评分和爬网格实验评价大鼠的运动功能恢复情况,并进行免疫组化鉴定,光学显微镜观察移植神经干细胞的存活和迁移。结果:在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。与对照组相比,神经干细胞移植组明显修复了损伤结构,改善了下肢的功能,尤其是第9d移植组。结论:神经干细胞移植促进了脊髓损伤后神经结构和功能的恢复,是治疗脊髓半切伤一种有效方案,考虑综合因素移植干细胞的最佳时机应选损伤后9d左右。
- 曹中伟刘洪文曾倩包翠芬齐志敏秦书俭
- 关键词：神经干细胞多向分化
- 不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长影响的比较被引量：5
- 2007年
- 目的:采用组织块培养法、单细胞悬液法、滤网过滤改良法分离培养鼠胚胎成纤维细胞,比较不同分离方法对其生长形态、生长曲线及细胞周期的影响。方法:实验于2006-03/09在辽宁医学院解剖实验室完成。①选取清洁级昆明种七八周龄雄性小鼠10只,4周龄雌性小鼠20只,雄雌鼠按1∶2合笼,次日晨检查有阴栓者记为孕0.5d,选择孕12.5～14.5d雌鼠断颈处死,取出胎鼠,去除胚胎头部、内脏和四肢,将躯干部用无菌眼科剪剪成1mm3以下的碎块,分别用以下方法进行分离培养。②组织块培养法:将剪碎的组织块吸置于离心管内,加入1mL消化液(含2.5g/L胰蛋白酶和0.4g/L乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液),吹吸30s,加入等体积的完全培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)终止消化,弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物,按相互距离0.5cm放入培养瓶内,培养箱静置2～4h后,加入适量完全培养基,3d换液一次。③单细胞悬液法:将剪碎的组织块加入1mL消化液,吹打30s,室温下静置3～5min,吸取上层液体,再加入消化液,重复上述操作五六次,最后弃组织块,将收集的上层液离心,1000r/min离心5min,弃上清液,加入完全培养基5mL,吹打均匀后吸至培养瓶内培养。培养条件、换液时间与组织块培养法相同。④滤网过滤改良法:将剪碎的组织块加入1mL消化液,吹打30s,37℃水溶箱中轻摇3～5min,加入完全培养基1mL终止消化,室温下静置1.0～2.0min,用直径5cm、孔径为150目滤网过滤后,将过滤液以1000r/min离心5min;弃上清液,加入适量完全培养基,轻吹30～50下,吸至培养瓶内,37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养24h,半量换液,以后3d换液一次。⑤检测不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长形态、生长曲线及细胞周期的影响。结果:①鼠胚胎成纤维细胞生长形态观察:组织块培养法第2天可见少量成纤维细胞,细胞生长缓慢,需要七八天才能传代�
- 张海锋单伟秦书俭
- 关键词：成纤维细胞胚胎细胞分离细胞培养技术
- 损伤脊髓组织液对大鼠骨髓基质细胞向神经细胞诱导分化的研究被引量：5
- 2005年
- 目要:探讨成年大鼠骨髓基质细胞在损伤脊髓组织液中向神经细胞分化的可能性,为神经再生及脊髓损伤的治疗提供一种新方法。方法:从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞并传至第5代,将正常、伤后1d,伤后1周及伤后3周脊髓提取液加入细胞培养基中,观察细胞形态的变化,并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达NSE特异性标志物。结果:加入脊髓提取液诱导后24h,部分细胞的形态已发生改变,48h后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征,而目NSE等特异性抗体呈阳性表达。结论:损伤脊髓组织液能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞。
- 梅晰凡秦书俭范广宇郑德宇李德超
- 关键词：骨髓基质细胞神经元样细胞
- 提高胚胎大鼠神经干细胞数量的实验方法
- 2006年
- 目的:通过培养了解神经干细胞的生物学特性,着重从胎龄选择、优化分离和换液方法上提高神经干细胞的增殖能力和生长数量。方法:实验于2004-04/2005-09在锦州医学院中心实验室完成。①雌性SD大鼠35只,每日做阴道细胞涂片,排卵期雌雄合笼,以出现精栓计为受孕第0.5天。分别于孕10.5,11.5,12.5,13.5,14.5,16.5,18.5d取出大鼠胚胎体,每时间点各5只。②通过采用机械分离和酶消化分离相结合的方法分离培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞。③换液首次采用分瓶法以后采用低速离心半量换液。④采用免疫细胞化学技术分别检测神经干细胞特征性标志巢蛋白表达和用血清诱导分化为大量神经元微管组合蛋白2和神经胶质纤维酸性蛋白表达。结果:①胎龄为12.5d的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,其次为13.5d。②在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢蛋白阳性的神经球。③用血清诱导分化为大量表达微管组合蛋白2阳性的神经元和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经胶质细胞。结论:考虑到生长因子在孕13～15d能够很好地发挥作用,故选择胎龄为13.5d胎鼠作为实验材料较为合适。通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离和原液首次采用分瓶法显著提高了神经干细胞的培养数量,培养出的细胞具有自我更新能力和增殖能力,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。
- 曹中伟曾倩马虹秦书俭
- 关键词：干细胞细胞分离细胞培养
