北京市自然科学基金(7052044)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：向志光栗占国张连峰陈振军赵义更多>>
- 相关机构：澳大利亚墨尔本大学北京大学中国医学科学院北京协和医学院更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- HLA－DRα和HLA-DRB1^＊0405表达载体的构建及其在真核细胞中的表达被引量：3
- 2007年
- 目的构建HLA-DRα和HLA-DRB1*0405真核表达载体,并使其在哺乳动物细胞内得到表达。方法从含HLA-DRα全长cDNA的质粒中扩增HLA-DRα的ORF序列,通过酶切将载体pIRES2-EGFP中的EGFP切除,将HLA-DRαORF插入到载体中;采用RT-PCR方法从HLA-DRB1*0405阳性人外周血单个核细胞中克隆出HLA-DRB1*0405 ORF序列,将其插入pIRES2-DRα载体的多克隆位点处,构建出真核表达载体pIRES2-DRαβ1*0405。对构建的载体进行限制性内切酶鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入小鼠成纤维细胞系DAP2.3中,通过流式细胞术和间接免疫荧光法对HLA-DRα和HLA-DRB1*0405的表达进行检测。结果酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致。流式细胞术检测约41.41%的转pIRES2-HLA-DRαβ1*0405载体的细胞呈阳性,间接免疫荧光显示HLA-DRα和HLA-DRB1*0405在转基因细胞中得到表达并形成完整的HLA-DR4分子,表达于胞膜及胞质内。结论成功构建出真核表达载体pIRES2-DRαβ1*0405,并在小鼠成纤维细胞系中得到表达,为下一步进行稳定细胞系的建立和转基因鼠模型的构建奠定了基础。
- 赵义向志光陈振军张连峰栗占国
- 关键词：真核表达类风湿
- 人类白细胞抗原DR4（＊0405）表达细胞系的建立
- 2007年
- 目的构建人类白细胞抗原（HIA）DR4（＊0005）真核表达载体，并使其在小鼠成纤维细胞系中得到稳定表达。方法从含且HLA-DRA全长eDNA的质粒中扩增HLA．DRA的开放读码框（ORF）序列，通过酶切将载体pIRES2-EGFP中的增强绿色荧光蛋白（EGFP）切除，将HLA-DRAORF插入到载体中；采用RT-PCR方法从HLA．DR4（＊04051阳性人外周血单个核细胞中克隆出HLA-DRB1＊0405ORF序列，将其插入pIRESrDRct载体的多克隆位点处，构建出真核表达载体pIRES，DRccβ＊0405。对构建的载体进行限制性内切酶鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入小鼠成纤维细胞系DAP2．3中，G418抗性筛选，并进行单克隆扩增。通过流式细胞术对细胞克隆进行鉴定，筛选出高表达HLA．DR4（＊0005）的细胞株，并采用激光共聚焦显微镜观察H1A-DR4（＊0405）在小鼠成纤维细胞中的表达情况。结果酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与Genbank一致。流式细胞术筛选得到了高表达HLA-DR4（＊0005）的稳定转染细胞株，阳性率达到74．65％。激光共聚焦显微镜观察证实HLA-DR4（＊0405）分子在小鼠成纤维细胞系得到了表达，主要分布于胞膜及胞质内。结论成功构建出真核表达载体pIRES2-DRαβ1＊0405，并在小鼠成纤维细胞系中获得稳定表达，为进一步开展HM-DRB1＊0405的功能研究和转基因鼠模型的建立奠定了基础。
- 赵义向志光陈振军张连峰栗占国
- 关键词：人类白细胞抗原真核表达类风湿关节炎
