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幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆、表达及抗体制备被引量：1: 2010年; 目的：构建表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）NCTC 11637 IV型分泌系统cagM（HP0537）全长编码基因的原核表达载体,分析其抗原性并制备抗体。方法：应用PCR技术从H.pylori基因组扩增cagM基因片段,TA克隆后测序分析,并构建表达载体pET-28a（＋）-cagM,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE及鉴定表达蛋白,表达蛋白以Ni2＋-NTA柱进行纯化,用软件分析其抗原性后,免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价。结果：测序结果表明cagM基因全长1 131 bp（基因库登录号为GU269568）,编码376个氨基酸,与基因库中已知菌株J99,26695和G27的氨基酸同源性为98%~99%;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明,在43 700处发现一条新生条带,Ni2＋-NTA柱纯化后为单一条带,软件分析表明其抗原性较强,免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶1.6×105。结论：首次成功克隆并表达了H.pyloripNCTC 11637cagM基因,并制备了其抗体,为以后进一步研究其生物学功能以及H.pylori相关疾病的检测与治疗奠定了基础。; 田树伟邵世和韩军黄河黄世腾; 关键词：幽门螺杆菌抗体

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备: 2010年; 目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)Cag致病岛(Cag-pathogenicity island,Cag-PAI)编码的hp0540基因的原核表达系统,并制备其多克隆抗体。方法:应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段,克隆至pMD18-2T载体后,进行序列测定,并对其序列进行生物信息学分析;构建pET-28a-hp0540原核表达载体,转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE法鉴定目的蛋白的表达,并以Ni2+-NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果:成功克隆了hp0540基因,全长1 086 bp,编码361个氨基酸,与基因库公布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性为98%。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为39 000,经Ni2+-NTA柱纯化后可获得重组蛋白,重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1∶160 000的多克隆抗体。结论:成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定了基础。; 韩军邵世和谢立苹黄世腾田树伟黄河; 关键词：幽门螺杆菌 CAG致病岛多克隆抗体

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因缺失株的构建与鉴定被引量：1: 2011年; 目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)IV型分泌系统cagX基因缺失株,为研究cagX基因的功能奠定基础。方法:利用基因同源重组原理,设计cagX基因上下游同源臂片段,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后酶切鉴定,将纯化后的同源臂片段连接到含卡那霉素抗性基因的载体pBluescript SKⅡ(-),即cagX基因自杀质粒pBlueKM40-ΔcagX;自杀质粒电击转化HpNCTC 11637,通过卡那霉素筛选基因缺失株,后经PCR和DNA测序鉴定。结果:构建成功了幽门螺杆菌cagX基因自杀质粒,并转化至HpNCTC 11637内。结论:成功获得了幽门螺杆菌cagX基因缺失株Hp11637-ΔcagX。; 高小焕邵世和段秀杰谢立苹; 关键词：幽门螺杆菌同源重组基因缺失

幽门螺杆菌外膜蛋白cagL基因的克隆、表达及其对IL-8 mRNA表达的影响: 2010年; 目的：克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）NCTC11637菌株cagL基因,并探讨其对IL-8mRNA表达的影响。方法：设计cagL引物,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后测序分析,用信息学软件分析其物理化学特性,并构建表达载体cagL-PET28 a（＋）转化E.coliBL-21（DE3）,IPTG诱导表达,镍亲和层析纯化,SDS-PAGE及蛋白质印迹鉴定表达蛋白。纯化蛋白与细胞GES-1共培养,提取细胞总RNA,RT-PCR检测细胞IL-8mRNA表达。结果：测序分析表明cagL编码成熟肽的碱基序列为654 bp,编码217个氨基酸,与基因库公布的其他H.pylori菌株的基因序列同源性为96%~98%,氨基酸同源性为97%~99%,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域;表达蛋白的相对分子质量约为32 000,蛋白质印迹检测融合蛋白具有良好的抗原活性;重组蛋白作用于GES-1细胞后,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达。结论：CagL蛋白可刺激GES-1细胞IL-8 mRNA的表达。; 黄世腾邵世和韩军黄河田树伟; 关键词：原核表达白细胞介素-8

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江苏省高校自然科学研究项目(08KJB3120001)