国家高技术研究发展计划(20024032)
- 作品数：4 被引量：19H指数：3
- 相关作者：李永哲高扬朱立平佟大伟刘音更多>>
- 相关机构：北京协和医院中国医学科学院中国协和医科大学吉林北方肝胆医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 原发性胆汁性肝硬化患者调节性T细胞及其与肝功能损伤的研究被引量：6
- 2005年
- 目的检测原发性胆汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis,PBC)患者外周血CD4+CD8+T、CD4+CD25+调节性T细胞亚群,探讨其与肝功能损伤、抗AMAM2抗体产生的关系。方法采用流式细胞术检测北京协和医院住院和门诊PBC患者(n=27)外周血CD4+CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞群比例,以26例其他肝脏疾病患者作为疾病对照组,30例健康体检者作为正常对照,观察调节性T细胞亚群与患者的肝功能指标及自身抗体如AMAM2、ANA的关系。结果PBC患者外周血CD4+CD25+T细胞比例与正常对照组比较结果差异无统计学意义(P>0.05),但显著高于其他肝脏疾病组(P<0.05)。CD4+CD8+T细胞群与正常人相比结果差异无统计学意义,其他肝病组明显高于正常对照组(P<0.05)。PBC患者外周血NK细胞比例显著低于正常对照组(P<0.05)。肝功严重损伤的PBC患者外周血CD4+CD25+T细胞比例明显高于肝功能轻度损伤者(P<0.05)。PBC患者外周血CD4+CD25+T细胞数量与肝功能损伤指标ALB呈负相关(r=-0.338,P<0.05),与TBIL、DBIL呈正相关(r分别为0.362,0.386,P<0.05)。CD4+CD25+/CD4+比例与GGT呈负相关(r=-0.335,P<0.05),与TBIL、DBIL呈正相关(r分别为0.333,0.339,P<0.05)。抗AMAM2抗体阳性患者外周血CD4+CD25+细胞比例明显高于AMAM2阴性患者(P<0.01)。未发现CD4+CD25+T、CD4+CD8+T细胞比例在ANA+和ANAPBC患者之间差异有统计学意义。结论PBC患者外周血CD4+CD25+T细胞群比例与肝功能损害和抗AMAM2抗体的产生密切相关,因此推测CD4+CD25+T细胞的变化可能是导致病情发展以及肝脏损伤的关键环节之一。
- 李永哲胡朝军刘定华佟大伟张蜀澜
- 关键词：胆汁性CD4阳性T淋巴细胞CD8阳性T淋巴细胞
- 核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探被引量：9
- 2005年
- 目的克隆人核包膜蛋白自身抗原gp210、p62和LBR基因,构建重组表达质粒,获得具免疫学活性的纯化重组蛋白,建立酶联免疫吸附法(ELISA),初探抗核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗体在原发性胆汁性肝硬化(PBC)诊断中的意义。方法构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21、M15中表达;融合蛋白经NiNAT树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)及免疫印迹法(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA,检测60名健康体检者、68例原发性胆汁性肝硬化(PBC)、60例病毒性肝炎、60例结缔组织病患者血清中抗gp210、p62和LBR抗体。结果经重组质粒测序和酶切结果证实,gp210、p62和LBR目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;SDSPAGE检测表达产物分别在69000、62000和27000处有一明显的蛋白表达条带,WB分析表明重组蛋白具有人gp210、p62和LBR抗原反应性。ELISA检测标本血清结果显示,PBC中,抗gp210抗体、抗p62抗体和抗LBR抗体阳性率分别为36.8%、30.9%和5.9%;而病毒性肝炎组、结缔组织病组和健康体检组中,除抗gp210抗体在结缔组织病患者中阳性率为1.7%外,3种自身抗体检测结果均为阴性。PBC组3种自身抗体阳性率与疾病对照组及正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。结论本研究成功克隆人核包膜蛋白自身抗原gp210、p62和LBR基因,并将其在大肠杆菌中成功表达。应用纯化融合蛋白建立的ELISA检测抗gp210抗体、抗p62抗体和抗LBR抗体,对PBC具有较好特异性,为PBC的特异性临床诊断提供了有效的工具。
- 李永哲刘镭孙庆国曾常茜赵振国佟大伟张蜀澜 高扬于孟学 朱立平
- 关键词：自身抗原
- 人干燥综合征A抗原重组体的构建及鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-52kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSA-52kDcDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源Hela细胞总RNA作为模板,反转录RT-PCR扩增人干燥综合征SSA-52kD抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠杆菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对DNA测序结果进行鉴定分析。结果RT-PCR扩增产物为1447bp。重组质粒PET-30a-SSA-52kD经BglⅡ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。结论成功克隆人SSA-52kD基因,并构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD。
- 李倩高扬倪安平于孟学朱立平刘音李永哲林嘉友甘晓丹
- 关键词：CDNA克隆重组体
- 人干燥综合征B抗原重组体的构建及融合表达
- 2008年
- 目的克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren’s syndrome antigen B,SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSB。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达。结果RT-PCR扩增产物为1245bp。重组质粒PET-30a-SSB经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性。结论成功克隆SSB基因并表达融合蛋白。
- 李倩高扬倪安平于孟学朱立平刘音李永哲林嘉友甘晓丹
- 关键词：CDNA克隆重组体
