国家高技术研究发展计划(2011AA100603)
- 作品数：57 被引量：77H指数：5
- 相关作者：于威张耀洲吕正兵陈健聂作明更多>>
- 相关机构：浙江理工大学中国农业科学院生物技术研究所中国农业科学院特产研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划浙江省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 家蚕N-乙酰基转移酶基因BmNAT的克隆与表达分析
- 2016年
- N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase,NAT)是昆虫体内一种催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的酶,主要与色素沉积、生理节律等有关。对已公布的家蚕(Bombyx mori)N-乙酰基转移酶基因Bm NAT(Gen Bank登录号:NP_001040401.1)进行生物信息学分析:该基因序列全长763 bp,ORF为564 bp,编码187个氨基酸残基,分子质量21.4 k D;多序列比对表明Bm NAT与脐橙螟(Amyelois transitella)同源蛋白质的序列相似性最高。通过原核表达的方法制备了融合Bm NAT蛋白,经蛋白质纯化并免疫新西兰兔获得多克隆抗体。亚细胞定位显示Bm NAT主要存在于细胞质和细胞核中。利用Western blotting检测Bm NAT在家蚕不同发育时期和5龄幼虫各组织器官的表达谱,结果表明Bm NAT在蛾、卵期以及5龄幼虫的头部表达量较高,与Bm NAT的qRT-PCR检测结果基本一致,初步推断Bm NAT可能在家蚕的这些组织或发育时期发挥一定的生物学功能。流式细胞实验显示Bm NAT对细胞周期可能存在一定的影响。
- 程旭升李斌聂作明盛清
- 关键词：家蚕N-乙酰基转移酶基因克隆原核表达亚细胞定位
- 家蚕核型多角体病毒orf61基因缺失对病毒复制和各时期基因转录的影响被引量：1
- 2017年
- orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P<0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。
- 薛圣杰李俊余海鹏张媛媛张媛媛全滟平于威
- 关键词：家蚕核型多角体病毒病毒复制基因转录调控
- 热休克蛋白HSC70--4及其乙酰化修饰在家蚕杆状病毒侵染过程中的功能研究
- 蚕桑是浙江省具有地区优势的传统特色产业，也是浙江省农业的十大主导产业之一，对主产区的农业增效和农民增收都起着十分重要的作用。然而，家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm...
- 毛赋翔
- 关键词：核型多角体病病毒侵染热休克蛋白乙酰化修饰
- 猫ω-like干扰素在家蚕中的表达和生物活性检测
- 2015年
- 干扰素在畜牧养殖业和宠物治疗中可以用于治疗病毒性传染病和提高疫苗免疫效力。用杆状病毒表达系统在家蚕中表达猫ω-like干扰素,将猫ω-like干扰素基因进行优化后合成,克隆到杆状病毒转移载体p VL1393上,与病毒复制基因失活拯救型Bm Bacmid病毒DNA共转染Bm N细胞系,获得重组Bm NPV病毒,猫ω-like干扰素基因位于多角体基因启动子下游,用重组病毒感染家蚕收获表达产物。采用细胞病变法利用干扰素抑制VSV-GFP感染猫肾细胞的方法来测定干扰素活性,结果显示干扰素效价可以达到4.53×106IU/m L以上。研究结果有望为研制新型动物干扰素疫苗提供参考。
- 刘兴健杨鑫张志芳李轶女易咏竹胡小元
- 关键词：杆状病毒表达系统抗病毒活性
- 约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究
- 2014年
- 通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25(217AA)和Pys48(455AA),以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。
- 李伟杰盛稳稳陈剑清于威吴祥甫崔立旺张耀洲舒特俊
- 关键词：疫苗
- 家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究被引量：1
- 2014年
- 从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。
- 张玉洪叶挺盛清陈健于威王丹吴祥甫张耀洲聂作明
- 关键词：表达谱分析免疫共沉淀
- 家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV的RBD蛋白及其免疫原性研究被引量：1
- 2014年
- 利用杆状病毒表面展示技术,构建展示SARS-CoV的棘突蛋白(spike protein)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的重组杆状病毒vBmgp64-RBD,并进一步研究其展示目的蛋白的免疫原性。结果表明:RBD蛋白正确表达并成功展示在病毒囊膜表面,将灭活的纯重组杆状病毒vBmgp64-RBD皮下注射BALB/c小鼠能产生抗RBD蛋白的特异性抗体,且抗体具有抗RBD蛋白的中和作用。证明vBmgp64-RBD有可能作为一种基于杆状病毒的新型SARS疫苗,为SARS的体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础。
- 闫晶晶张耀洲陈剑清于威舒特俊
- 关键词：SARS-COV
- 家蚕表达重组人乳铁蛋白及产物对溃疡性结肠炎的治疗作用
- 2014年
- 乳铁蛋白(LF)在抗炎和参与机体免疫调节方面具有重要作用。利用家蚕杆状病毒表达系统构建含人乳铁蛋白(hLF)基因的重组病毒Bm-hLF,接种蚕蛹表达重组人乳铁蛋白(rhLF),ELISA法检测rhLF的表达量,体外抑菌试验检测其抑菌活性,并建立小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型,探究口服rhLF蚕蛹粉对UC的治疗效果。结果表明:rhLF在蚕蛹感染重组病毒120h后表达量最高达0.38mg/mL蚕蛹匀浆上清液;rhLF蚕蛹粉能抑制E.coli TG1的生长;口服rhLF蚕蛹粉可明显降低UC小鼠的疾病活动指数(DAI)、髓过氧化物酶(MPO)含量,减轻结肠组织炎症损伤,为今后开发一种新型、廉价的UC口服药物提供药效学实验参考。
- 赵红玉张耀洲于威舒特俊陈剑清
- 关键词：蚕蛹抑菌活性口服溃疡性结肠炎
- 家蚕杆状病毒(BmNPV)Bm122基因的缺失影响芽生型病毒粒子的形成
- 2016年
- 为研究家蚕杆状病毒（BmNPV）编码的Bm122基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别构建了Bm122-ko-bacmid和Bm122-re-bacmid,实现对Bm122基因的敲除和异位补回。进而将Bm122-kobacmid、Bm122-re-bacmid、wtbacmid（野生型）分别转染BmN细胞,病毒滴度测定结果显示：Bm122缺失后,病毒无法形成正常水平的芽生型病毒粒子（budded virus,BV）,表明该基因是病毒生成有感染力的BV所必需的基因;透射电子显微镜观察发现,Bm122敲除后细胞内未观察到杆状病毒粒子,进一步证实Bm122的缺失影响了BV的生成。qPCR结果显示,Bm122缺失后病毒DNA复制水平降低。结果表明,Bm122是病毒生成正常水平的BV所必需的基因。
- 朱丽萍于威陈滨何欢解纯刚
- 关键词：BAC-TO-BAC系统病毒复制
- 威尔姆氏瘤基因1对肾脏和性腺发育影响的研究进展
- 2014年
- 威尔姆氏瘤基因1(Wilms tumor gene 1,WT1)是与威尔姆氏瘤相关的,在威尔姆氏瘤中发生功能失活的基因。同时,WT1基因编码的锌指蛋白在调节不同组织和不同类型细胞的正常分化中又扮演着很重要的角色。研究发现,WT1基因敲除小鼠会出现无肾脏、性腺缺失及视网膜畸形等症状。同时,在正常性别发育过程中,WT1基因还可维持雄性体征。因此,在发育过程中,WT1基因与肾脏及性腺细胞的存活及分化密切相关,但其具体机制需进一步研究。
- 安培培李春义
- 关键词：肾脏性腺
