国家自然科学基金(30500236)
- 作品数：11 被引量：20H指数：3
- 相关作者：李定国孙超陈源文兰玲汪保灿更多>>
- 相关机构：上海交通大学医学院附属新华医院河南省人民医院更多>>
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- 肝损伤大鼠骨髓源性肝干细胞的筛选分化与扩增被引量：2
- 2006年
- 目的探讨利用肝损伤早期和淤胆血清培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选、诱导分化和扩增肝干细胞亚群,以快速、高效地获取骨髓源性肝干细胞。方法建立淤胆型肝损伤大鼠模型和制备含5%淤胆血清病理条件培养液,以促进骨髓源性肝干细胞的体内、外筛选和扩增,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养2周时骨髓细胞各种肝干细胞标志表达。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,细胞表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。结论淤胆型肝损伤早期大鼠体内环境和含淤胆血清体外病理微环境可能有效地从骨髓细胞中筛选骨髓源性肝干细胞,从而为临床细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞。
- 孙超李定国陈源文汪保灿孙巧玲
- 关键词：骨髓源性肝干细胞细胞培养干细胞肝损伤
- 转基因骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠细胞外基质积聚的影响被引量：2
- 2008年
- 目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）基因修饰骨髓源性肝干细胞（BDLSC）移植对四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化大鼠肝脏细胞外基质（ECM）积聚的影响。方法体外将携带人uPA基因的腺病毒（AduPA）转染BDLSC。采用皮下注射CCl4方法建立大鼠肝纤维化模型。将纯系Fisher大鼠随机分为正常组、模型组、BDLSC组（尾静脉注入2×10^6BDLSC）和BDLSC—uPA组（尾静脉注入2×10^6AduPA转染的BDLSC），各9只。观察各组大鼠肝功能和血清ECM水平的变化；采用半定量逆转录（RT）-PCR方法检测大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原（COLⅠ、COLⅢ）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、3、9及金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）-1、2mRNA的表达。结果BDLSC—uPA组大鼠肝功能明显改善；血清ECM水平和羟脯氨酸含量明显低于模型组和BDLSC组；肝组织COLⅠmRNA（38．9±2．7）、COLⅢ mRNA（8．5±1．6）表达均明显低于模型组和BDLSC组（均P〈0．05），MMP-2 mRNA（157．5±32．6）、MMP-3 mRNA（105．5±14．6）、MMP-9mRNA（187．5±22．8）表达均高于模型组和BDLSC组（均P〈0．05），而TIMP-1、2mRNA的表达则差异无统计学意义（P〉0．05）。结论uPA基因修饰BDLSC移植可能通过上调MMP的表达。促进ECM的降解，从而改善纤维化大鼠的肝功能，抑制大鼠肝纤维化。
- 孙超李定国陈源文陈颖伟汪保灿
- 关键词：尿纤溶酶原激活物基质金属蛋白酶类骨髓源性肝干细胞
- 腺病毒介导的白介素10基因体外转导大鼠β_2m-/Thy-1^+骨髓源性肝干细胞被引量：7
- 2008年
- 目的研究腺病毒介导的白介素10(interleukin 10,IL-10)基因(AdIL-10)体外转导β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞(bonemarrow-derived liver stem cell,BDLSC)的可行性。方法利用免疫磁珠细胞分选(magnetic bead cell sorting,MACS)方法分选大鼠β2m-/Thy-1+BDLSC,RT-PCR法鉴定其肝相关性表型的表达。AdIL-10转导BDLSC,根据腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达率测定转导效率,采用RT-PCR法和ELISA法分别检测IL-10的基因表达和蛋白分泌水平。采用MTT法和免疫荧光染色法分别检测腺病毒转导对BDLSC增殖能力和肝细胞样表型白蛋白(albumin,ALB)表达的影响。结果MASC法能成功分选纯化BDLSC,其在基因水平表达肝细胞样表型。AdIL-10转导BDLSC的效率呈剂量依赖性,最佳转染复数为500pfu/cell。AdIL-10修饰BDLSC高表达IL-10基因,且持续高浓度分泌IL-10蛋白至胞外。AdIL-10转导72h后,BDLSC仍保持正常的增殖能力和ALB表达。结论BDLSC是AdIL-10转导的适宜载体,为AdIL-10修饰BDLSC这一新型结合方式用于慢性肝病的治疗奠定了实践基础。
- 兰玲陈源文孙超孙巧玲李定国
- 关键词：骨髓源性肝干细胞腺病毒载体白介素10基因转导
- 大鼠β_2m^-/Thy-1^+骨髓源性肝干细胞的体外分选及鉴定被引量：7
- 2007年
- 目的尝试从骨髓干细胞(BMSC)中分选出具备干细胞和肝细胞双重特性的β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞(BDLSC)亚群,为细胞移植治疗肝病提供合适的供体细胞。方法利用免疫磁珠细胞分选(MACS)方法体外分选淤胆型大鼠模型的β2m-/Thy-1+BDLSC,流式细胞仪检测其纯度,RT-PCR法和免疫荧光染色法鉴定其肝相关性表型的表达。结果MACS法能成功分选纯化BDLSC,其在基因和蛋白水平均表达肝细胞样表型。结论β2m-/Thy-1+BDLSC是BMSC中较特异的肝干细胞亚群,具有可能益于肝病治疗的巨大潜力。
- 兰玲孙超陈源文李定国
- 关键词：骨髓干细胞肝干细胞磁珠分选
- Smad7和uPA基因共表达对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响
- 2007年
- 目的观察Smad7和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)基因共表达对体外培养肝星状细胞(HSC)活化、分泌胶原特性的影响。方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离大鼠HSC,将AdSmad7/uPA或AdSmad7体外感染HSC后,Western blot-ting法检测细胞总蛋白中Smad7、抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α2链(ColⅠA2)的表达;ELISA法检测培养上清中uPA蛋白的分泌量;放射免疫法测定HSC培养上清中Ⅲ型前胶原(PⅢP)和层黏连蛋白(LN)的分泌量。结果AdSmad7/uPA感染体外培养HSC,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,转染效率>90%,Smad7和uPA蛋白的表达量明显高于AdGFP对照;AdSmad7/uPA或AdSmad7转染HSC均可使α-SMA、ColⅠA2、PⅢP和LN水平较AdGFP对照组显著下降(P<0.05)。与转染AdSmad7相比,转染AdSmad7/uPA后的HSC中ColⅠA2、PⅢP和LN表达降低更明显,分别较前者降低44.5%、30.4%和28.4%(P<0.05)。结论Smad7和uPA基因共表达可协同抑制体外培养的大鼠HSC分泌细胞外基质成分。
- 宗春华汪保灿陈颖伟孙超李定国
- 关键词：SMAD7尿激酶型纤溶酶原激活剂肝星状细胞
- 腺病毒介导人uPA感染大鼠间充质干细胞的体外研究
- 2009年
- 目的体外分选与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并用腺病毒介导的人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)体外感染原代MSCs,观察病毒的转导效率及对MSCs增殖的影响。方法通过黏附培养分离纯化MSCs,并采用免疫组化DAB显色法鉴定;荧光显微镜检测uPA的转染效率;Western blotting检测uPA在MSCs中的表达;MTT法检测病毒对MSCs增殖的影响。结果分选培养的MSCs呈典型的间充质干细胞生长形态,细胞表面标记物CD29和CD90阳性,CD34和CD45阴性;随着病毒感染滴度增高,绿色荧光蛋白(GFP)的表达率亦呈增高趋势。当感染复数(MOI)=80且病毒转导72 h后,GFP阳性细胞数占细胞总数的比例达(94.0±1.5)%,可稳定表达7 d以上,且对MSCs的增殖无明显影响。结论MSCs是一种理想的基因过表达载体,稳定分泌uPA蛋白,可用于肝纤维化的研究。
- 胡俊杰孙超兰玲李定国
- 关键词：间充质干细胞尿激酶型纤溶酶原激活物肝纤维化
- 骨髓干细胞移植与肝纤维化被引量：5
- 2007年
- 近年来,骨髓干细胞移植被认为是治疗各种肝脏疾病最具潜力的措施之一,其在肝纤维化中的应用研究也日益增多。但肝纤维化本身的慢性病程及病理特征使骨髓干细胞移植的应用具有一定的特殊性。此文针对应用于肝纤维化的骨髓干细胞的移植优势、移植部位、输注途径、种植分化、治疗效果及作用机制作一阐述,为从事骨髓干细胞移植治疗肝纤维化的研究者提供借鉴和指导。
- 兰玲李定国
- 关键词：骨髓干细胞细胞移植肝纤维化
- 尿激酶型纤溶酶原激活物基因转染骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠肝细胞再生的影响被引量：1
- 2011年
- 目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）基因修饰骨髓源性肝干细胞（BDLSC）移植对四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化大鼠肝细胞再生的影响。方法纯系Fisher344雄性大鼠10只，为BDLSC供体大鼠。体外将AduPA转染雄性大鼠BDLSC。纯系Fisher344雌性大鼠36只，均分为正常组（皮下注射橄榄油）、模型组（CCI4造模，尾静脉注射0．9％氯化钠）、BDLSC组（CCl4造模，尾静脉输入BDLSC）、转基因组（CCl4造模，尾静脉输入转基因BDLSC）。检测大鼠肝功能和肝组织胶原面积。半定量RT—PCR方法检测大鼠肝组织肝细胞生长因子（HGF）及其受体c—metmRNA表达水平。免疫组织化学法检测大鼠肝组织增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达。结果正常组、模型组、BDLSC组、转基因组肝组织胶原染色面积分别为0．12％±0．03％、14，49％±1．40％、8．25％±0．82％、5．12％±0．40％，组间差异均有统计学意义（P值均〈0．05）。与模型组和BDLSC组相比，转基因组大鼠肝功能明显改善，血清透明质酸（HA）、血清Ⅲ型前胶原（PCUI）、肝组织羟脯氨酸含量明显降低，肝组织HGF和c—metmRNA水平均显著上调，PCNA蛋白表达显著增加。结论uPA基因修饰BDLSC移植可能诱导肝细胞增殖，从而改善CCl4诱导肝纤维化大鼠的肝功能。
- 孙超李定国陈源文陈颖伟汪保灿
- 关键词：尿纤溶酶原激活物干细胞移植肝细胞增殖细胞核
- 转染大鼠白细胞介素10基因的骨髓源性肝干细胞移植治疗大鼠肝纤维化
- 2009年
- 目的探讨转染大鼠白细胞介素10（IL-10）基因的β2m^-／Thy-1^＋骨髓源性肝干细胞（BDLSC）移植对大鼠肝纤维化的治疗效果。方法分选Wistar大鼠的β2m^-／Thy-1^＋ BDLSC，转染大鼠IL-10基因。Wistar大鼠皮下注射CCl4，制作肝纤维化模型，分为3组：（1）模型组，经大鼠门静脉分支输注无菌生理盐水1ml；（2）BDLSC组，经大鼠门静脉分支输注β2m^-／Thy-1^＋ BDLSC悬液1ml（含2×10^5个细胞）；（3）IL-10组，经大鼠门静脉分支输注转染IL-10基因的β2m^-／Thy-1^＋ BDLSC悬液1ml（含2×10^5个细胞）；另以皮下注射橄榄油的Wistar大鼠为对照（正常组）。用细胞核染色剂二脒基苯基吲哚（DAPI）标记β2m^-／Thy-1^＋ BDLSC，以观察该细胞在肝内的定位情况。观察各组大鼠肝组织病理学改变和胶原的沉积情况，检测其肝功能和凝血功能。结果大鼠肝组织中可见DAPI标记的β2m^-／Thy-1^＋ BDLSC。模型组大鼠的肝组织病理学改变明显，BDLSC组病理学改变有所减轻，IL-10组的组织形态最接近正常组。模型组大鼠肝组织内胶原沉积明显增多，BDLSC组胶原沉积较少，IL-10组胶原沉积明显减少。IL-10组大鼠的血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和胆红素总量（TBIL）以及全血凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血激酶时间（APTT）均低于模型组，差异均有统计学意义（P〈0．05），其中ALT、TBIL、PT和APTT均降至正常组水平，与BDLSC组相比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论转染大鼠IL-10基因的β2m^-／Thy-1^＋ BDLSC移植对大鼠肝纤维化有一定的治疗效果。
- 兰玲陈源文孙超刘博伟孙巧玲李定国
- 关键词：肝硬化骨髓祖代细胞白细胞介素10
- LentiviralHGF的构建及其体外对β_2m^-/Thy-1^+ BDLSCs影响的
- 2009年
- 目的构建携带大鼠HGF基因的慢病毒载体,并观察慢病毒对体外分选的β2m-/Thy-1+BDLSCs转染效果及影响。方法采用RT-PCR法从大鼠肝脏中提取HGF基因,并将其克隆到穿梭质粒TG006,与包装质粒一起在293T细胞中重组产生LentiviralHGF慢病毒。通过免疫磁珠法体外分选出β2m-/Thy-1+BDLSCs;采用荧光显微镜检测LentiviralHGF对BDLSCs的转染效率;采用ELISA法检测大鼠HGF的蛋白分泌水平;采用MTT法和免疫荧光法分别检测病毒对增殖和分化的影响。结果从纤维化大鼠肝脏中成功克隆出HGF基因,并构建LentiviralHGF慢病毒;慢病毒能高效转染BDLSCs。转染慢病毒的BDLSCs向胞外分泌高浓度的HGF。转染LentiviralHGF后,细胞增殖能力提高,ALB表达阳性。结论LentiviralHGF能高效转染BDLSCs,两者结合为肝纤维化的研究奠定了基础。
- 胡俊杰孙超兰玲李定国
- 关键词：慢病毒基因转导
