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中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(ITBB110303): 作品数：16 被引量：48H指数：4; 相关作者：刘志昕张雨良王健华王洪星余乃通更多>>; 相关机构：中国热带农业科学院海南大学海南省农业科学院更多>>; 发文基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项国家现代农业产业技术体系建设项目国家自然科学基金更多>>; 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>

甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测体系研究被引量：3: 2013年; 甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染料法检测ScYLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明:该检测体系能特异地检出ScYLV,对测试的高粱花叶病毒不能检出,灵敏度比常规PCR高100倍,适用性广。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理且SYBR Green I荧光染料成本较低,适用于检测甘蔗体内含量较低的ScYLV病毒。; 王洪星龚殿张雨良王健华刘志昕; 关键词：甘蔗黄叶病毒

海南番木瓜PRSV和PLDMV病毒发生情况及分子鉴定被引量：12: 2013年; 对海南昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚5个主要番木瓜产区的病毒病发生情况进行调查。对76份番木瓜疑似病毒样品进行检测,检测结果表明海南番木瓜病毒病主要有2种:由番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)引起的番木瓜环斑病毒病和由番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)引起的番木瓜畸形花叶病毒病。其中,番木瓜环斑病毒病最为常见,检出率达77.63%,是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病;畸形花叶病毒病发生率很低,仅检出2例番木瓜畸形花叶病毒病样品。以PRSV病毒基因组P1和Hc-Pro作为靶标基因进行分子克隆、测序,结果表明海南地区PRSV病毒可明显分为2个株系:HNPRSV-1株系和HN-PRSV-2株系。此外,基于CP基因的系统进化树分析结果表明在海南新发现的PLDMV病毒可能源于台湾和日本。本研究可为开展番木瓜花叶病的防控和创制抗花叶病毒番木瓜新种质提供数据参考。; 张雨良黄启星郭安平曾会才赵辉孔华刘志昕; 关键词：番木瓜 PRSV 分子鉴定系统进化树

海南甘蔗病毒病的调查及其病原分子鉴定被引量：1: 2014年; 海南是我国重要的甘蔗生产省份之一，但其甘蔗主要种植区感染病毒的种类和数量尚不十分清楚，且海南甘蔗花叶病病原病毒缺乏分子水平的系统鉴定。为明确海南甘蔗病毒病的种类、数量、分布及危害情况，本研究拟建立较为完整的甘蔗病毒病检测技术体系，对海南甘蔗病毒病展开调查，为甘蔗抗病毒基因工程及健康种苗发展提供参考。; 王洪星张雨良余乃通罗志文王建华杨文君刘志昕; 关键词：甘蔗生产分子鉴定病原病毒抗病毒基因工程甘蔗花叶病分子水平

感染BBTV香蕉叶片cDNA文库的构建及评价: 2013年; 为了研究香蕉束顶病毒与香蕉寄主致病的互作分子机制，本文报道利用Make Your Own＂Mate＆Plate＂ Library System试剂盒成功构建感染BBTV香蕉叶片的cDNA文库。通过改良CTAB法提取感染BBTV香蕉叶片的总RNA，采用SMART法反转录合成双链cDNA，经靳，酶切并去除短片段之后，与经同样酶切的pGADT7-SfiI载体连接，利用电转法将重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得初级cDNA文库，最后以初级文库100万克隆为基数扩增，得到扩增文库并提取质粒。结果得到库容量大于2．0X10。的初级文库，检测表明文库cDNA插入片段长度主要分布在700—2000bp，文库重组率为87．5％。结果表明，该文库质量较好，可用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验，本研究为开展病毒与寄主互作的研究奠定基础。; 谭老喜张雨良周朋章绍延王健华张秀春刘志昕; 关键词：香蕉束顶病毒香蕉叶片

应用多重RT-PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒被引量：8: 2011年; 建立了多重RT-PCR同时检测甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)和高粱花叶病毒病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)的技术体系,该体系可有效地对甘蔗田间植株和试管苗进行检测。根据引物之间的互补性及引物的Tm值筛选多重PCR引物。确定适宜的PCR缓冲液的浓度为1×,退火温度为53℃,延伸温度为72℃。; 王洪星张雨良罗志文杨文君龚殿孙玉娟张树珍刘志昕; 关键词：多重RT-PCR 病毒检测甘蔗

香蕉束顶病毒Haikou2分离物DNA2编码框原核表达及抗血清制备: 2012年; 香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产。BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究。本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2 ORF,将其构建到pET32a载体中,进行原核表达和抗血清制备。结果表明重组表达载体pET32a-DNA2ORF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21 ku的特异融合蛋白,通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0 mmol/L IPTG诱导3 h。融合蛋白经过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清。Western blot实验表明抗血清具有特异性;酶联法(ID-ELISA)测定表明,抗血清效价达到25 000,能够检测出香蕉汁液中加入的0.954μg/mL浓度的表达纯化蛋白。; 谭老喜王洪星张雨良王健华章绍延周朋余乃通刘志昕; 关键词：原核表达抗血清制备

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证: 2012年; 采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段。将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKT7-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用。研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础。; 张雨良黄启星张树珍王健华余乃通刘志昕; 关键词：CP 酵母双杂交诱饵载体

海南地区番木瓜花叶病病原的分子鉴定与多样性分析被引量：1: 2014年; 番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)和番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)是热带、亚热带地区严重威胁番木瓜农业生产的主要病害。本研究对27份疑似番木瓜花叶病病叶样品进行分子鉴定,提取病叶总RNA,反转录获得对应的cDNA,根据PRSV病毒的CP、P1、Hc-Pro和NIb基因序列和PLDMV病毒的CP基因序列设计特异性引物进行PCR检测和测序分析。研究发现PRSV感染20例(74.1%),PLDMV感染3例(11.1%),PRSV和PLDMV交叉感染的样品1例(3.7%)。多样性分析结果表明,海南地区PRSV病毒存在3个株系,株系之间出现明显分化;海南地区PLDMV病毒与日本和台湾地区报道的PLDMV病毒株系有共同的起源。研究结果表明PRSV和PLDMV是海南地区番木瓜花叶病的主要病原,其中PRSV病毒3个株系之间P1基因同源性在95%以下,这可为后续研究构建抗PRSV和PLDMV的双价表达载体提供数据支持。; 张雨良黄启星朱丽娣孔华曾会才姜浩元刘志昕; 关键词：番木瓜 PRSV

ScYLV和SrMV的PCR引物优化设计被引量：4: 2012年; 以甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,,ScYLV)和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,,SrMV)为材料,运用DNAMAN、Primer Premier 5.0和Oligo6.0等软件设计PCR引物,,进行普通PCR、多重PCR、实时定量PCR反应,检验所设计引物的PCR扩增效率、特异性和有效性。归纳总结多种PCR反应中引物设计的一般性思路,提出启发性的方法,并将以上经验付诸实践检验;最后将研究思路概括为:针对性、实用性和一般性。; 王洪星张雨良罗志文杨文君刘志昕; 关键词：甘蔗黄叶病毒 PCR 引物设计 PRIMER

应用多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒被引量：4: 2012年; 基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量PCR(real time-quantitative,RT-qPCR)检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8～82.8℃和84.6～86.6℃。检测数据显示:SrMV和ScYLV均有各自的特异性峰值出现,而健康植株无特异性峰值;在单独检测中的检出水平分别可达500和250 copy/μL;两种病毒Tm值的批内变异系数分别为0.03%和0.02%,批间变异系数分别为2.06%和3.12%。综上所述,所建立的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法在对以上两种病毒的检测中具有较好的特异性、敏感性和稳定性。; 王洪星张雨良王健华章绍延熊国如刘志昕; 关键词：甘蔗黄叶病毒 SYBR 病毒检测

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