国家自然科学基金(30300016)
- 作品数：11 被引量：37H指数：4
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- 抗炭疽保护性抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析被引量：5
- 2007年
- 目的:克隆并分析抗重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)单克隆抗体4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因。方法:从分泌抗rPA特异性单抗的杂交瘤细胞株4B2、5E1和2A8中提取总RNA;利用RT-PCR技术克隆抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,并将其连入pMD18-T载体中进行测序分析。结果:4B2VL基因全长378bp,VH基因全长414bp;5E1VL基因全长420bp,VH基因全长426bp;2A8VL基因全长384bp,VH基因全长342bp。通过分析,这些基因均符合小鼠IgGV区基因的特征,含有4个框架区、3个抗原互补决定区,而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。结论:克隆了抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。
- 李冰李建民徐俊杰刘树玲张羽付玲陈薇
- 关键词：炭疽芽胞杆菌单克隆抗体
- 重组炭疽致死因子的表达及生物活性分析被引量：16
- 2004年
- 使用分泌型表达质粒 ,实现了重组炭疽致死因子 (rLF)在大肠杆菌周质腔中的分泌表达。表达量约占菌体总蛋白的 4 %。经过离子交换和凝胶过滤纯化 ,每升诱导培养物可获得约 3mg电泳纯的rLF。蛋白N端测序表明 ,rLF序列与天然炭疽LF一致。体外细胞毒性试验亦显示rLF具有很好的生物活性。rLF的成功表达为今后研究LF的作用机理、发展新型炭疽疫苗。
- 郭强徐俊杰董大勇付玲陈薇宋小红
- 关键词：炭疽杆菌蛋白表达蛋白纯化大肠杆菌
- 炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR-Fc在CHO细胞中的表达被引量：5
- 2005年
- ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。
- 高丽华胡显文陈薇徐俊杰赵剑陈惠鹏
- 关键词：FC融合蛋白重组CHO细胞抗毒素
- 炭疽保护性抗原受体结合区的关键氨基酸位点分析
- 2005年
- 目的分析炭疽毒素保护性抗原(PA)受体结合区与其功能相关的关键氨基酸位点。方法通过定点突变的方法将PA的Asp683分别突变成为一系列带有不同电荷以及不同长度侧链的氨基酸,通过细胞毒性实验分别探询电荷及立体结构对其活性的影响。同时对Asp683的一些邻近氨基酸进行了定点突变的研究。结果细胞毒性实验显示,不同的突变导致了PA活性不同程度的下降,其中Asp683电荷的改变对其活性的影响尤为明显,但当它突变为不带电荷的氨基酸时,PA仍然保留了一定的活性;而当Asp683突变为带正电的Lys后,PA却保留了相对较高的活性。结论Asp683所带的负电荷在PA与其受体的相互作用中起着关键的作用,但PA与其受体之间的相互作用可能还通过一些其他方式进行。
- 葛猛徐俊杰于少洋董大勇李冠霖赵剑付玲陈薇
- 关键词：定点突变细胞毒性实验
- 炭疽毒素受体胞外区在毕赤酵母中分泌表达、纯化与活性鉴定被引量：6
- 2005年
- 使用分泌型表达载体,实现了重组炭疽毒素受体胞外区(rATR(CMG2)-EXCELL)在毕赤酵母KM71H培养物上清中的分泌表达.表达量约占培养物上清总蛋白质的20%.经过螯合柱初步纯化,每升诱导培养物可获得约1mg电泳纯的rATR(CMG2)-EXCELL.体外与配基PA结合试验和细胞保护试验显示,rATR(CMG2)-EXCELL具有很好的生物活性.rATR(CMG2)-EXCELL的成功表达为今后研究炭疽毒素受体的作用机理、发展新型炭疽治疗药物打下基础.
- 赵剑徐俊杰缪静李冰杨秀旭宋小红陈薇
- 关键词：炭疽杆菌蛋白质表达毕赤酵母
- 炭疽毒素受体及其与保护性抗原结合机制的研究进展被引量：2
- 2006年
- 本文阐述了炭疽毒素的细胞表面受体研究及其与保护性抗原结合分子机制等方面的进展。到目前为止,共发现两种炭疽毒素受体,分别由TEM8和CMG2基因编码。炭疽毒素受体的发现和鉴定对炭疽的病理学研究具有重要的意义,而且体外实验发现的受体与毒素的高亲和力也为受体本身作为炭疽的治疗剂带来了希望。CMG2和PA结合状态晶体结构的解析使我们能够对毒素进入细胞质过程的分子细节有所推论。所建立的理论模型为研究其他类型穿透细胞膜发挥作用的毒素的作用过程提供了重要的参考。
- 赵剑徐俊杰陈薇
- 关键词：炭疽芽孢杆菌保护性抗原
- 重组炭疽水肿因子的表达与生物活性分析被引量：1
- 2005年
- 炭疽毒素包括3种蛋白因子,即保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。EF是钙调蛋白依耐的腺苷酸环化酶,可使细胞cAMP浓度升高,导致宿主防御能力下降。为深入研究炭疽毒素的作用机理,构建了原核表达质粒,在大肠杆菌中表达出重组EF(rEF)。经鉴定,rEF以可溶形式表达于细菌胞质中。经过金属螯和层析、阳离子交换层析和凝胶层析,每升诱导培养物可获得约5mg重组蛋白。用重组蛋白免疫家兔获得了兔多抗,能够在细胞试验中中和rEF ,体外细胞试验显示rEF具有很好的生物活性,在J774A .1和CHO细胞试验中,能与LF共同竞争和PA的结合位点,相互抑制。上述工作为深入研究炭疽毒素的作用机理。
- 董大勇徐俊杰宋小红付玲陈薇李冠霖葛猛
- 关键词：炭疽杆菌炭疽毒素
- 炭疽杆菌芽孢外壁胶原样蛋白(BclA)的多态性分析被引量：1
- 2006年
- 炭疽杆菌芽孢外壁胶原样蛋白(Bc lA)是芽孢外壁发状菌丝的主要结构成分,也是芽孢的主要免疫原。从国内分离的3株炭疽杆菌中克隆出Bc lA基因并进行了序列分析,结果发现有2株(A16R和40048)的Bc lA与国外报道菌株长度不同,分别含有388个和322个氨基酸,72个和50个GXX三氨基酸重复序列,5个和3个含21个氨基酸的(GPT)5GDTGTT重复序列(Bc lA重复)。另一株40022的Bc lA与国外报道的53169株完全一致,含有370个氨基酸,66个GXX重复,5个Bc lA重复。对我国炭疽杆菌Bc lA蛋白多态性的分析为进行炭疽杆菌的基因分型以及研究炭疽芽孢的免疫原性和致病机理打下基础。
- 李冠霖徐俊杰董大勇宋小红陈薇
- 关键词：炭疽杆菌多态性芽孢
- 炭疽毒素受体ATRcDNA的合成和克隆及ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体的构建被引量：4
- 2005年
- 可溶性炭疽毒素受体(sATR)可以特异性结合炭疽毒素保护抗原(PA),为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物,构建了表达ATRFc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp的编码炭疽毒素受体N端1～227氨基酸的基因分成长约50～60碱基的18个寡核苷酸片段,相邻片段重叠部分为20～22个碱基,利用重叠延伸PCR和引物PCR法,将合成的片段组装与扩增,得到了含有ATR1～227的全部编码区和HindIII、BamHI位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamHI/HindIII双酶切连接到pUC19质粒中,挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定,获得了全序列正确的克隆。将ATR基因与Fc基因连接后插入pcDNA3.1载体多克隆位点HindIII和NotI之间,得到表达ATRFc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATRFc,为利用CHO哺乳动物细胞表达ATRFc并研究其生物学性质奠定了基础。
- 胡显文高丽华陈薇徐俊杰赵剑陈惠鹏
- 关键词：FC融合蛋白基因合成抗毒素
- 炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达与纯化被引量：4
- 2004年
- 目的 在大肠杆菌中表达炭疽菌保护性抗原受体结合区。方法 将大肠杆菌外膜蛋白A(OmpA)的信号肽序列融合到炭疽菌保护性抗原 (PA)受体结合区 ,即PA结构域 4 (PA D4 )基因的5′端 ,构建成分泌型表达质粒 ,在大肠杆菌中尝试PA D4的表达 ,并对重组蛋白进行纯化和鉴定。结果 重组PA D4以可溶形式表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 10 %。经过离子交换层析和凝胶过滤纯化 ,每升诱导培养物可获得约 10mgPA D4。蛋白N端测序表明PA D4与天然序列一致。免疫印迹试验显示PA D4可与抗PA血清结合。结论 在大肠杆菌中实现了PA D4的分泌型表达 ,为进一步评估其作为新型疫苗和潜在治疗药物的可能性打下基础。
- 葛猛徐俊杰李冰董大勇宋小红郭强赵剑陈薇
- 关键词：受体结合保护性抗原炭疽菌免疫印迹试验信号肽序列离子交换层析
