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国家自然科学基金(30772036)
国家自然科学基金(30772036)
- 作品数：23 被引量：74H指数：6
- 相关作者：封志纯田兆方李玉红刘秀香付雪梅更多>>
- 相关机构：北京军区总医院南方医科大学南京医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金山东省优秀中青年科学家科研奖励基金山东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合骨髓间充质干细胞对高氧暴露新生大鼠肺损伤的干预作用被引量：2
- 2010年
- 目的探讨重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage—colony stimulating factor，GM—CSF）联合大鼠骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）对高氧暴露新生大鼠肺损伤的影响。方法采用贴壁选择法分离、培养、扩增大鼠骨髓来源MSCs，并以4’，6二脒基-2-苯吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）进行标记，注射前以PBS按要求剂量予以稀释；3日龄清洁级SD新生大鼠32只，置于95％氧环境下7d后，随机（随机数字法）分为4组，每组8只；高氧＋GM—CSF组＋MSCs组（A），高氧＋GM—CSF组（B），高氧＋MSCs组（c），高氧对照组（D）；A，B组大鼠于模型结束后皮下注射GM—CSF9μg/kg，A组同时还予腹腔注射5X104MSCs；C组予模型后腹腔注射5X104MSCs，D组仅注射相同容积的PBS，于注射后72h（13f3龄）处死全部动物，肺组织病理学检测辐射状肺泡计数（radical alveolar counts，RAC）；ELASA法检测肺组织匀浆TNF-α，IL-1β含量；免疫组化检测肺组织端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcrip tase，TERT）积分；荧光显微镜观察DAPI阳性细胞分布情况。结果（1）四组在RAC（P〈0．01）、肺组织匀浆TNFG（P〈0．01），IL-1β（P〈0．01）水平等方面差异均有统计学意义；与D组相比，A，B，C三组RAC值增加（P〈0．05），TNF-α,IL-1β水平下降（P〈0．05）；A组与B、A组与C组差异也均有统计学意义（P〈0．05）。（2）四组在TERT积分差异也有统计学意义（P〈0．01）；A，B组明显增高（P〈0．05）；而C，D两组 间差异均无统计学意义（P〉O．05）。（3）免疫荧光显微镜下A，C组可见DAPI阳性细胞，分别为（6．23±1．88），（5．10±0．91）（P〈0．05）。结论GM—CSF、MSCs对高氧暴露可引致新生大鼠肺损伤均具有保护作用，涉及多种作用机制，联合治疗具有协同作用。
- 田兆方李玉红付雪梅封志纯
- 关键词：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子高氧骨髓间充质干细胞
- 高迁移率族蛋白B1和α平滑肌肌动蛋白在支气管肺发育不良中的表达及意义被引量：1
- 2011年
- 目的检测高迁移率族群蛋白B1(HMGB1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在中浓度高氧(60%O2)暴露新生小鼠肺组织损伤模型肺中的表达水平,探讨HMGB1在支气管肺发育不良(BPD)发病机制中的作用。方法新生足月C57BL/6小鼠随机分为氧处理组和空白对照组,制备中浓度高氧致新生鼠BPD模型,应用HE染色、放射性肺泡计数、免疫荧光和实时荧光定量-PCR技术观察生后第3、7、14天肺组织病理改变,HMGB1和α-SMA的蛋白及mRNA表达水平。结果氧处理组随时间推移,出现肺泡上皮肿胀,肺泡壁增厚,间质水肿,炎症细胞浸润,胶原样物质产生,较空白对照组明显发育迟滞。氧处理组HMGB1蛋白和mRNA在第7、14天时表达均强于相应空白对照组(P<0.05)。氧处理组α-SMA蛋白和mRNA在第3、7、14天表达均强于相应空白对照组(P<0.05)。HMGB1与α-SMA表达呈线性关系(P<0.05)。结论在600 ml/L氧暴露所致BPD中,HMGB1和α-SMA表达增加。BPD的病理过程可能与HMGB1表达增加及α-SMA活化有关。
- 赵国英冯洁罗瑶
- 关键词：支气管肺发育不良高氧症高迁移率族蛋白质类肌动蛋白类
- 慢病毒介导TGF-β1 siRNA对高体积分数氧致新生小鼠肺损伤的影响被引量：6
- 2009年
- 目的:探讨以慢病毒介导的小分子干扰RNA技术(siRNA)沉默转化生长因子β1(TGF-β1)基因对高体积分数氧致新生小鼠肺损伤的影响.方法:将100只新生昆明小鼠随机分为高氧组、干扰组、阴性干扰组、空气组4组,每组动物25只.分别构建含TGF-β1短发卡RNA(shRNA)及阴性对照序列的PRNAT-u6.2载体,慢病毒包装.于小鼠出生后3d时将两类慢病毒载体以鼻腔吸入法分别导入干扰组和阴性干扰组小鼠肺内.出生后4～14d时将高氧组、干扰组、阴性干扰组小鼠置于含600mL/LO2的氧箱内饲养.空气组仅置空气下饲养.出生后4,7,14,21,28d时分别随机杀取各组5只动物并取左上肺制作石蜡切片,进行组织形态学变化观察,测定放射状肺泡计数(RAC)和肺泡平均截距(MLI).右肺组织以RT-PCR,Western Blot法分别检测TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平.结果:经测序和双酶切鉴定,表达TGF-β1 shRNA的慢病毒载体构建成功;干扰组肺组织TGF-β1 mRNA水平在小鼠出生后4d即明显低于其他3组(P<0.05);出生后7,14,21,28d时干扰组TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均低于高氧组和阴性干扰组,但高于空气组(P均<0.05).出生后7,14,21,28d干扰组MLI低于高氧组和阴性干扰组而高于空气组(P均<0.05).RAC高于高氧组和阴性干扰组而低于空气组,差异均具有统计学意义(P<0.05).高氧组与阴性干扰组在各时间点上述各项指标的差异无统计学意义.结论:慢病毒载体介导的TGF-β1小分子干扰RNA对高体积分数氧吸入所致新生小鼠肺损伤具有保护作用.
- 段江陈洪清李然尹晓娟封志纯北京军区总医院附属八一儿童医院
- 关键词：转化生长因子Β1小分子干扰RNA高体积分数氧支气管肺发育不良小鼠
- 人骨髓来源问充质干细胞对新生大鼠高氧肺损伤干预作用的研究被引量：6
- 2008年
- 目的研究人骨髓来源间充质干细胞对新生大鼠高氧肺损伤的干预作用。方法采用贴壁选择法分离、培养、扩增hMSCs，并予BrdU进行标记；32只3日龄SD大鼠随机分为A、B、C、D4组，每组8只；A组：高氧暴露＋hMSCs注射组，B组：空气暴露＋hMSCs注射组，C组：高氧暴露对照组，D组：空气暴露对照组。A、C组：高氧（95％）暴露后7d，腹腔分别注射含5×10^5MSC的磷酸盐缓冲液（PBS）、单纯的PBS50μl，B、D组：空气暴露后7d，腹腔分别注射含5×10^5hMSCs的PBS、单纯的PBS50μl。注射后3d处死全部动物取肺组织，ELASA法检测肺组织匀浆TNFα、TGFβ1水平；免疫组织化学方法检查肺组织BrdU积分情况，HE染色观察肺组织学形态学结构，做辐射状肺泡计数（RAC）；RT—PCR方法检测各组肺组织Alu序列表达情况。结果（1）A、B、C、D4组TNFα水平分别为142．933±24．017，79．033±11．573，224．088±41．915，76．500±10．373（F=59．970．P=0．000）；而TGFβ1水平分别为1726．484±91．086，1530．359±173．441，2047．717±152．057，1515．777±131．049（F=24．977，P=0．000）。（2）RAC值分别为11．145±1．331，13．941±0．985，9．595±0．672，14．819±1．080（F=43．234，P=0．000）。（3）RT—PCR检测显示A、B组均有Alu序列表达，而C、D组均未见Alu序列表达。免疫组织化学显示A、B组均有BrdU阳性染色细胞，BrdU积分分别为0．230±0．026，0．190±0．015，t=3．769，P=0．002；C、D组均未见阳性染色细胞。结论新生大鼠腹腔注射hMSC后肺组织有hMSCs定植，且与暴露的条件相关；hMSCs可改善新生大鼠因高氧引致的肺组织损伤。
- 田兆方杜江付雪梅王斌洪小杨封志纯
- 关键词：间质干细胞高氧症
- 支气管肺发育不良小鼠模型的建立被引量：12
- 2009年
- 目的建立支气管肺发育不良小鼠模型。方法将30只4日龄雌性昆明小鼠随机分为2组,每组15只,氧气组置于氧箱(FiO20.6),空气组置于空气中(FiO20.21),分别于暴露7 d、14 d、21 d时每组随机选取5只,称重后处死,观察肺组织形态学、放射状肺泡计数(radical alveolar counts,RAC)及肺胶原含量变化。结果氧气组各时间点体重较空气组均明显降低(P<0.001);实验21 d时氧气组肺组织HE染色下见正常肺泡结构破坏,肺泡隔增厚,肺泡融合;氧气组RAC较空气组显著降低(P<0.001);肺胶原天狼猩红特殊染色见Ⅰ型、Ⅲ型胶原增生,较空气组显著增加(P<0.001)。结论中等浓度氧(FiO20.6)暴露21 d可致小鼠肺发生类似人类支气管肺发育不良改变。
- 黄铃沂段江封志纯
- 关键词：支气管肺发育不良胶原
- 转化生长因子-β_1在中浓度氧致新生鼠支气管肺发育不良模型中的作用被引量：5
- 2010年
- 目的:探讨中浓度氧(60%O2)暴露对新生小鼠发育的影响及损伤,并观察转化生长因子-β1(TGF-β1)在新生鼠慢性肺部疾病支气管肺发育不良(BPD)肺损伤中的作用。方法:30只新生雌性KM小鼠,随机分为实验组和对照组,每组15只。对照组置于空气中(FiO20.21);实验组置于封闭氧箱中(FiO20.6),制备中浓度氧致新生雌性小鼠BPD模型,记录吸氧后2 d、7 d、14 d、21 d、28 d小鼠体重,应用HE染色观察不同时间点HE染色肺组织病理改变,免疫组化技术观察TGF-β1蛋白表达水平。结果:实验组小鼠体重吸氧7 d后明显降低,HE染色下正常肺泡结构消失、肺泡融合、肺泡间隔增厚。高氧暴露72 h后,TGF-β1的表达升高,随着吸氧时间的增长TGF-β1的表达逐渐升高。结论:持续较高浓度吸氧可致新生雌性小鼠生长障碍和肺泡化阻滞,出现类似人类支气管肺发育不良的肺部改变。TGF-β1在肺纤维化的发生和持续过程中均发挥重要作用。
- 张志梅封志纯
- 关键词：高氧支气管肺发育不良肺损伤转化生长因子-Β1
- 高氧对大鼠AECⅡ细胞的损伤及hMSC的干预作用观察被引量：1
- 2008年
- 原代培养新生大鼠肺泡Ⅱ型细胞(AECⅡ)放入Transwell-Clear底层上(预置盖玻片),随机分为A、B、C、D 4组,每组6复孔。A、B组置于95%O2+5%CO2中培养,而C、D组则在95%空气+5%CO2中培养;24 h后留取上清并换液,A、C组在Inserts中加入人骨髓间充质干细胞(hMSC)进行共培养,而B、D组则不加;24 h后再留取上清。采用ELASA法检测培养上清中肿瘤坏死因子α(TNFα)、转化生长因子β1(TGFβ1)的含量;Hoechst染色检测Transwell-Clear底部AECⅡ细胞凋亡情况。免疫组化检测Transwell-Clear Inserts中人骨髓MSC特异性SP-A的表达情况。高氧暴露导致新生大鼠AECⅡ培养液中TNFα、TGFβ1含量增加,细胞凋亡增加。而与hMSC共培养后TNFα、TGFβ1含量降低,细胞凋亡减少。认为高氧暴露导致新生大鼠AECⅡ分泌功能改变,细胞凋亡增加;而与hMSC共培养对AECⅡ的损伤具有保护作用。
- 刘秀香田兆方李玉红封志纯
- 关键词：高氧间充质干细胞
- 骨髓间充质干细胞对高氧暴露新生大鼠肺损伤的干预作用被引量：2
- 2008年
- 目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）对高氧引致新生大鼠肺组织损伤的干预作用。方法采用贴壁选择法分离、培养、扩增大鼠骨髓MSC，并以5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）进行标记，注射前以磷酸盐缓冲液（PBS）稀释；32只3日龄SD大鼠随机分为4组：A、C组高氧（95％）暴露7d后，腹腔分别注射含和不含5×10^4MSC的PBS各50μl；B、D组空气暴露7d后，腹腔分别注射含和不含5×10^4MSC的PBS各50μl。于注射后72h（13日龄）腹腔注射10％水合氯醛后放血处死，肺组织病理学检测辐射状肺泡计数（RAC）；支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数检测白细胞及其中性粒细胞；ELAsA法检测肺组织匀浆肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β含量。免疫组化双染法检测BrdU和肺泡表面活性物质结合蛋白a（SP—A）表达情况。结果（1）RAC（个）：4组比较差异有统计学意义（11．0±1．0、13．9±1．1、9．6±0．7、14．0±1．1，P=0．000）；A、C组均明显低于D组（均P〈0．05），A组高于C组（P〈0．05）。（2）BALF细胞计数：4组白细胞（10^5／ml：0．85±0．21、0．18±0．10、1．44±0．69、0．21±0．06）和中性粒细胞（10^5／ml：0．32±0．12、0．06±0．02、0．73±0．35、0．07±0．02）计数比较，差异均有统计学意义（均P=0．000）；A、C组均明显高于D组（均P〈0．05）；A组均低于C组（均P〈0．05）。（3）肺组织匀浆TNF-α及IL-1β含量：4组肺组织匀浆TNF-α（pg／ml：173±20、34±4、224±42、35±4）及IL-1β含量（pg／ml：530±74、210±33、948±82、216±30）比较，差异均有统计学意义（均P=0．000）；A、C组均明显高于D组（均P〈0．05），A组低于C组（均P〈0.05）。（4）免疫组化：A、B组均有BrdU及SP-A阳性细胞，A组还可见免疫双染阳性细胞；C、D组仅见SP—A阳性细胞。结论腹腔注射MSC对高氧暴露新生大鼠的肺损伤起�
- 田兆方李玉红付雪梅封志纯杜江
- 关键词：间质干细胞高氧
- 肺泡Ⅱ型上皮细胞原代培养及高体积分数氧-停氧对其细胞内钙离子水平的影响被引量：2
- 2008年
- 目的原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEⅡ），并动态观察高体积分数氧（高氧）-停氧对其细胞内钙离子（[Ca^2＋]i）的影响，为体外研究AECⅡ及阐明高氧肺损伤发病机制提供实验基础。方法孕19d SD大鼠麻醉消毒后超净台内剖腹取出所有胎鼠。用胎鼠肺组织进行AECⅡ分离、纯化及原代培养，倒置相差显微镜下观察其细胞的形态及生长状况。通过激光共聚焦显微镜观察其肺表面活性蛋白C（SP—C）免疫荧光的阳性表达鉴定AECⅡ。鉴定为AECⅡ的细胞通以高氧（氧流量为3mL／min，测氧仪检测氧体积分数为930—970mL／L），持续约5min后立即停氧，用激光共聚焦显微镜动态观察[Ca^2＋]i的变化情况，记录其随时间改变的动态变化曲线，同时观察钙离子荧光强度的变化并连续拍摄照片。结果例置相差显微镜观察AECⅡ呈岛状分布，铺路石状，细胞核及核仁明显，胞核圆形，胞浆内较多颗粒。激光共聚焦显微镜下可见AECⅡ胞浆中呈现绿色荧光的SP—C阳性表达。予AECⅡ高氧刺激时，[Ca^2＋]i出现短暂下降后持续上升，上升至一定程度后又缓慢下降，甚至出现[Ca^2＋]i耗竭现象，并维持该水平。予停氧刺激，[Ca^2＋]i出现短暂下降后迅速上升，然后逐渐趋于平稳。随着[Ca^2＋]i水平的增减，Ca^2＋荧光强度相应的增强或减弱。结论高氧及给氧后停氧均可使[Ca^2＋]i产生明显变化，可能是高氧导致AECⅡ损伤的重要途径之一。
- 刘秀香巨容杨志军尹晓娟封志纯
- 关键词：高体积分数氧钙离子激光共聚焦显微镜
- 胎鼠肺泡Ⅱ型细胞的原代培养及鉴定被引量：6
- 2008年
- 实验于2007-10/12在北京军区总医院附属八一儿童医院实验室完成。取孕19dSD大鼠胎鼠肺组织进行原代培养,通过IgG包被瓶培养进行筛选纯化。分别于培养24,48,72h后检测细胞的活力;利用共聚焦显微镜及电镜对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行鉴定。各时间点Ⅱ型细胞活力均在90%以上,细胞纯度在91%以上,电镜下细胞胞浆内含有丰富的板层小体,细胞表面有微绒毛;共聚焦显微镜下细胞浆中有呈绿色荧光的SP-C阳性表达。胰蛋白酶加胶原酶消化,IgG包被瓶进行筛选所得肺泡Ⅱ型细胞活力及纯度均较高,可以作为肺泡Ⅱ型细胞的原代培养的常规方法;电镜和免疫荧光均可达到鉴定目的。
- 刘秀香杨志军陈洪清封志纯
- 关键词：原代培养
