国家自然科学基金(30772189)
- 作品数：8 被引量：27H指数：3
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- 白藜芦醇对大鼠急性脊髓损伤保护作用的量效关系研究被引量：1
- 2014年
- 目的探讨白藜芦醇(Res)对大鼠急性脊髓损伤保护作用的剂量效应关系。方法采用Allens脊髓打击损伤模型,将60只SD大鼠随机分为6组,每组10只。A组:假手术组;B组:脊髓打击伤组;C组:50mg/kg Res治疗组;D组:100mg/kg Res治疗组;E组:200mg/kg Res治疗组;F组:300mg/kg Res治疗组。术后24、48、72h运用BBB法分别进行运动功能评分;72h处死动物取材,HE染色、Nissl染色观察脊髓组织病理学变化。结果 BBB评分提示24、48、72h三个时间点C、D、E、F组较B组大鼠后肢运动功能均有不同程度的改善;72h时间点,C、D、E、F组较B组运动功能评分差异有统计学意义(P<0.05);Res组较B组的病理组织结构均有不同程度的改善;E组及F组运动功能评分及病理组织结构优于C组及D组,E组与F组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Res对大鼠脊髓损伤有较好的保护作用,并呈一定的剂量效应关系;200mg/kg是Res干预SCI的最佳剂量。
- 刘长江王保金张晨
- 关键词：白藜芦醇急性脊髓损伤量效关系
- 同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的时效性分析被引量：8
- 2013年
- 目的:观察脊髓损伤后不同时间点骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗后大鼠行为学变化、脊髓的病理改变及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)表达变化,探讨BMSCs的最佳移植时间。方法:80只健康成年SD大鼠随机分为8组,每组10只。A组为假损伤组,暴露胸10段脊髓但不造成冲击伤,B、C、D、E、F、G、H组以改良Allen法建立脊髓损伤模型。造模成功后,C、D、E、F、G、H组分别于损伤后0 h、6 h、24 h、3 d、5 d和7 d,将1×106体外培养的BMSCs用微量注射器注入于脊髓损伤局部,B组为单纯造模组,用等量细胞培养液代替。各组分别于损伤后1、2、4周进行脊髓运动功能BBB(Basso,Beattie,Bresnahan)运动学评分;分别取各组脊髓损伤组织0.5 cm,制作HE染色病理切片,观察其形态学改变;Elisa法检测各组大鼠脊髓BDNF和NGF表达情况。结果:假手术组1、2、4周大鼠脊髓功能BBB评分均明显高于其余7组(P<0.01);术后1周细胞移植各组评分与单纯造模组相比差异无统计学意义(P>0.05);术后2周和4周细胞移植各组评分高于单纯造模组(P<0.05);损伤后2周BBB评分从高到低依次为F、E、G、D、H、C组,但6组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);损伤后4周BBB评分,F组与其余5组(C,D,E,G,H组)比较差异有统计学意义(P<0.05),但其余5组组间差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA检测结果显示,F组BDNF和NGF含量均高于其他7组(P<0.05)。大鼠脊髓标本切片HE染色,假手术组脊髓组织结构完整清楚,无中性粒细胞浸润;其余7组局部组织水肿明显,灰白质交界处模糊,周围可见不同程度胶质细胞增生及炎细胞浸润。结论:大鼠脊髓损伤后同种异体BMSCs移植对脊髓功能恢复有一定疗效,损伤后3 d可能是BMSCs最佳移植时间。
- 段大鹏苏权胡伟尤武林党晓谦王坤正
- 关键词：脊髓损伤骨髓间充质干细胞脑源性神经营养因子神经生长因子
- 白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及通路的影响被引量：3
- 2013年
- 目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)对大鼠脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后细胞凋亡及通路的影响。方法采用Allen’s脊髓打击损伤模型(T8),将27只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组);损伤组(Control组);白藜芦醇处理组(Res组),每组9只。术后72 h,应用透射电镜观察脊髓组织细胞凋亡形态变化,免疫组化及Western blot等方法检测脊髓组织中凋亡蛋白表达的变化。结果:透射电镜观察显示Res能明显抑制脊髓神经细胞的凋亡。免疫组化及Western blot检测显示Sham组Bcl-2、Bax呈极少量表达;Control组Bax大量表达(P<0.05),Bcl-2表达则较低(P<0.05),两者比例失调,p38 MAPK及Caspase-3明显激活(P<0.05),神经细胞凋亡增加显著;与Control组相比,Res组Bax蛋白表达明显降低(P<0.05),Bcl-2表达则有所增高(P<0.05),p38MAPK及Caspase-3的激活明显受到抑制(P<0.05),脊髓组织超微结构损害有所改善,神经细胞凋亡显著减少。结论:Res通过提高Bcl-2/Bax蛋白表达比,抑制p38MAPK及Caspase-3的激活,使大鼠脊髓组织超微结构损害有所改善,神经细胞凋亡显著减少,并且可阻断p38 MAPK介导的信号转导通路。提示Res对大鼠SCI组织的神经细胞凋亡有较好的调控作用。
- 刘长江严春辉史斌
- 关键词：白藜芦醇脊髓损伤神经细胞凋亡通路
- 构建和鉴定神经生长因子-β腺相关病毒穿梭质粒被引量：2
- 2012年
- 目的构建能够表达神经生长因子-β重组腺相关病毒穿梭质粒,为进一步包装腺相关病毒奠定基础。方法利用高保真酶分别扩增pAAV-MCS的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连入T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,T4酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-U6/CMV-EGFP;培养人MIApaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到人ngf-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-ngf-β;将ngf-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒。结果酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4250bp、800bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白表达;质粒T-easy-ngf-β酶切可见3kb、736bp条带,测序显示基因序列正确;酶切pAAV-U6/CMV-ngf-β可见4300bp、736bp条带;质粒pAAV-U6/CMV-ngf-β测序显示载体中的基因序列正确。结论成功构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒,包装表达神经生长因子的腺相关病毒,为进一步深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础。
- 高大龙解俊杰李若飞党晓谦王坤正杨雷刚涂忠民
- 关键词：脊髓损伤腺相关病毒穿梭质粒
- 白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后炎症反应的影响被引量：12
- 2013年
- 目的探讨白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后炎症反应的影响。方法 63只SD大鼠随机分为假手术组、损伤组、白藜芦醇处理组,每组21只。假手术组仅行手术暴露,不给予打击及治疗;损伤组采用Allens打击法建立SD大鼠脊髓损伤模型;白藜芦醇组模型建立后给予白藜芦醇200mg/kg腹腔注射。术后24、48、72h采用ELISA法检测各组脊髓组织白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;比色法测定髓过氧化物酶(MPO)活性;免疫组化及Western blot法检测术后72h脊髓组织IL-1β、IL-10、TNF-α、MPO蛋白表达的变化。结果 24、48、72h各时间点白藜芦醇组较损伤组IL-1β、IL-10、TNF-α表达及MPO活性降低(P<0.05);72h免疫组化染色及Western blot检测显示,白藜芦醇组较损伤组TNF-α、IL-1β、IL-10及MPO的表达明显降低(P<0.05)。结论白藜芦醇可通过降低大鼠脊髓损伤后脊髓组织中炎性介质活性发挥对脊髓损伤的保护作用。
- 刘长江毕文超张晨时志斌王坤正
- 关键词：白藜芦醇脊髓损伤
- 髓磷脂相关抑制物66小分子干扰真核表达载体构建与筛选
- 2010年
- 目的构建并筛选出具有干扰作用的髓磷脂相关抑制物66(neurite outgrowth inhibitory 66,nogo66)小分子干扰RNA(samll interfering RNA,siRNA)真核表达载体,为进一步构建腺相关病毒载体奠定基础。方法设计2条针对大鼠nogo66基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和1条阴性对照序列,插入载体pGenesil-1.1,同时用pGenesil-1.1质粒作为空白对照,得到4种质粒pGenesil-nogo66-siRNA-1、pGenesil-nogo66-siRNA-2、pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb,对4种质粒进行DNA测序和酶切鉴定;培养大鼠胶质细胞瘤C6细胞,用4种质粒进行转染,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白,检测转染效率;采用RT-PCR和Western blot分别检测nogo基因在mRNA水平和蛋白水平的表达差异,筛选出对nogo66基因具有干扰作用的nogo66-siRNA表达质粒。结果DNA测序显示设计的2种质粒干扰序列正确;KpnⅠ/XhoⅠ双酶切4种质粒均可见800bp及4.3kb条带;4种质粒分别转染C6细胞后培养48h,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达,平均转染效率约为73%。RT-PCR和Western blot检测显示:与未转染细胞相比,转染pGenesil-nogo66-siRNA-1使nogo基因表达下降22%、蛋白表达下降73%,转染pGenesil-no-go66-siRNA-2使nogo基因表达下降28%、蛋白表达下降78%,差异均有统计学意义(P<0.05);而转染pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb后nogo基因表达和蛋白表达均无明显下降(P>0.05)。结论成功构建并筛选出具有干扰作用的nogo66-siRNA真核表达载体,为深入研究脊髓损伤修复奠定了理论基础。
- 李若飞党晓谦李建伟王坤正柏传毅包理忠娄高杰
- 关键词：真核表达脊髓损伤
- 双基因共表达腺相关病毒穿梭质粒的构建与鉴定
- 2009年
- 目的合成和筛选nog066-siRNA干扰片段，克隆神经生长因子-β（NGF-β），构建含nog066-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒。方法设计针对nog066的siRNA，插入载体pGenesil-1．1，转染大鼠胶质瘤C6细胞，通过RT-PCR和Western-blot检测筛选有效的干扰质粒；培养人MIApaca-2细胞，提取总RNA，进行RT-PCR得到人NGF-β基因，插入T-easy载体；将pGenesil-1．1与pAAV-MCS进行重组，得到含u6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV—U6／CMV—EGFP；将nog066一siRNA和NGF-β分别插入pAAV-U6／CMV-EGFP中，构建含nog066-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒。结果干扰质粒pGenesil-nogo66-siRNA测序显示十扰序列正确；RT-PCR结果显示转染后各条带相对亮度有差异，转染pGenesil-nog066-siRNA-1和pGenesil-nog066-siRNA-2使nogo基因表达降低；Western-blot结果显示转染pGenesil-nogo66-siRNA、1使NOGO蛋白表达下降73％，转染pGenesil-nog066-siRNA-2使NOGO蛋白表达下降78％，与未转染组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）；质粒T-easy-NGF-β酶切可见3000bp、736bp条带，测序显示基因序列正确；酶切pAAV-U6／CMV-EGFP、pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-EGFP町见4300bp、800bp条带．转染细胞后均可见绿色荧光蛋白表达；酶切pAAV-U6／CMV-NGF-β、pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-NGF-β可见4300bp、736bp条带；质粒pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列正确。结论成功构建了含有nog066-siRNA与NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿格质粒，为深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础。
- 李若飞李建伟党晓谦王坤正柏传毅包理中娄高杰
- 关键词：神经生长因子基因表达腺相关病毒
- 神经生长因子β腺相关病毒穿梭质粒的构建和鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的构建能够表达神经生长因子β(nerve growth factorβ,NGF-β)的重组腺相关病毒(adenoassociatedvirus,AAV)穿梭质粒,为进一步包装AAV奠定基础。方法利用高保真酶分别扩增pAAV-多克隆位点(multiple cloning site,MCS)的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连入T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,DNA连接酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组AAV穿梭质粒pAAV-U6/CMV-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP),用该质粒转染293细胞,观察有无绿色荧光表达;培养人Miapaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到NGF-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-NGF-β;将NGF-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建NGF-β重组AAV穿梭质粒pAAV-U6/CMV-NGF-β,将该质粒送基因测序。结果双酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4 250、800 bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光表达;质粒T-easy-NGF-β双酶切可见3 015、736 bp条带,测序显示基因序列正确;双酶切pAAV-U6/CMV-NGF-β可见4 250、736 bp条带;质粒pAAV-U6/CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列正确。结论成功构建NGF-β重组AAV穿梭质粒,为进一步深入研究脊髓损伤的基因治疗提供了实验基础。
- 李若飞高大龙党晓谦王坤正杨雷刚涂忠民
- 关键词：腺相关病毒穿梭质粒脊髓损伤基因治疗
