上海市自然科学基金(06ZR14138)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
- 相关作者：方勇杨鹏高徐鹏胡孝辉俞为荣更多>>
- 相关机构：上海交通大学医学院附属第三人民医院上海交通大学更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 不同冻存-解冻法处理小鼠皮肤组织对毛囊干细胞生长的影响
- 2009年
- 目的观察皮肤组织经不同冻存-解冻法处理后，分离的毛囊于细胞的生长状况，寻找较好的组织冻存方案，为解决无法短期收集足量标本而不能有效获取毛囊干细胞的问题提供实验方法参考。方法获取大鼠有两撮触须的上唇，经不同方法处理后，分离毛囊隆突部细胞。设立对照组：新鲜标本；实验组1：未加冻存保护剂-70cc冻存24h；实验组2：4℃保存24h；实验组3：1．4mol／L乙二醇作为冻存保护剂-70℃冻存24h；实验组4：1．4mol／LDMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24h；实验组5：1．4mol／LDMSO作为冻存保护剂-70％冻存3个月；实验组6：0．7mol／LDMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24h；冻存各组降温速率为0．5℃／min。其中3～6组分别采用单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖＋培养基漂洗快速复苏法做对比。比较经以上6种方法处理后分离的毛囊隆突部细胞的活力和贴壁、增殖情况。结果经冻存＋单用培养基漂洗快速复苏法，4℃处理组获得的平均细胞活力为90．38％±4．62％，明显高于其他处理组（P值均〈0．05），仅次于对照组94．00％±5．64％。1．4mol／LDMSO作为冻存保护剂无论冻存24h或3个月均可取得较高的细胞活力（56．00％±3．91％和47．25％±3．55％），明显高于其他处理组（P值均〈0．05）。组3-组6经单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖＋培养基漂洗快速复苏法复苏所得平均细胞活力分别是25．63％±2．32％和27．25％±2．56％、56．00％±3．51％和54．88％±4．03％、47．25％±3．01％和44．00％±2．98％、27．88％±2．20％和26．75％±2．26％，差异均不显著（P值均〉0．05）。各组毛囊干细胞生物学特性（贴壁、增殖等能力）与细胞活力呈相关趋势。结论皮肤组织在4℃条件短期内可保持原代培养细胞的活力；皮肤组织以1．4MDMSO为冻存剂-70℃条件下保存可较长时间保持�
- 杨鹏高方勇
- 关键词：皮肤毛囊干细胞
- 人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达
- 2009年
- 目的构建人β-连环蛋白（β-catenin）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定。方法提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定。质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度。包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率。结果RT-PCR及测序鉴定证实目的基因正确克隆至慢病毒载体中。在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108TU/mL。在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80%-90%。结论成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久。
- 杨鹏高胡孝辉高丰厚俞为荣徐鹏方勇
- 关键词：慢病毒Β-连环蛋白增强型绿色荧光蛋白
