国家自然科学基金(30271464)
- 作品数：40 被引量：124H指数：7
- 相关作者：隋延仿张秀敏司少艳葛伟胡沛臻更多>>
- 相关机构：第四军医大学第四军医大学西京医院解放军第306医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- MAGE-1与人HSP70融合基因真核表达载体的构建被引量：1
- 2006年
- 目的构建MAGE-1(melanomaantigen1)与人HSP70(heatshockprotein70)融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法利用PCR方法扩增人HSP70基因,经测序后连入真核表达载体pCDNA3.1,再通过PCR方法扩增MAGE-1基因,测序后插入HSP70基因的5'端,构建了MAGE-1与人HSP70融合基因表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70。结果成功地扩增了人HSP70基因与MAGE-1基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致,成功地构建了pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70真核表达载体。结论成功地构建MAGE-1与人HSP70融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70,为进一步DNA肿瘤疫苗研究提供了实验基础。
- 陈广生隋延仿宋宏萍叶菁黄亚渝马加海张秀敏
- 关键词：融合基因
- 肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2004年
- 目的 克隆肿瘤抗原MAGE 3基因 3’端 6 5 7bp片段 ,对其编码的蛋白羧基端 97～ 314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE 3基因全长cDNA的pUC19 MAGE 3质粒中经聚合酶链式反应 (PCR)扩增 3’端 6 5 7bp片段 ,并克隆入pGEX 4T 1载体 ,构建重组原核表达质粒pGEX MAGE 3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 6 6 0bp的条带 ,测序结果表明与GenBank公布的MAGE 3序列一致 ,成功地构建了pGEX MAGE 3原核表达质粒 ,含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基 β D 半乳糖苷 (Isopropyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后表达Mr 为5 4 0 0 0的谷胱甘肽巯基转移酶 (GlutathioneS transferse,GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 2 8%。结论 成功地构建了pGEX MAGE 3原核表达质粒 ,获得了MAGE 3蛋白羧基端 97～ 314aa融合蛋白 ,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。
- 马加海隋延仿叶菁黄亚渝陈广生张秀敏
- 关键词：原核表达聚合酶链式反应
- MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达被引量：5
- 2006年
- 目的:构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体,建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系(humanhepatocellularcarcinomacellline,HHCC)。方法:利用分子生物学方法,构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3,经脂质体法转染HHCC后,用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达,用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3mRNA的表达。结果:成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后,经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3mRNA转录和EGFP的表达。结论:建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC,为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。
- 张秀敏隋延仿司少艳李侠黄杨胡沛臻葛伟
- 关键词：基因转染绿色荧光蛋白
- 树突状细胞表面HSP70受体介导的内化作用被引量：1
- 2006年
- 目的研究树突状细胞(DCs)表面HSP70受体介导的内化作用。方法实验分为3组:HSP70受体封闭组、非受体封闭组和对照组,采用流式细胞仪检测C57BL/6小鼠骨髓来源DCs内化FITC标记的HSP70阳性细胞率。结果受体封闭组50μgHSP70可使DCs表面受体饱和;受体饱和后随HSP70-FITC用量的升高,HSP70-FITC阳性细胞数呈正比性增高;非受体封闭组应用50μgHSP70-FITC与100μgHSP70-FITC时HSP70-FITC阳性细胞率均达到90%以上且组间差别不大。结论DCs表面HSP70受体介导的内化作用是DCs摄取抗原的主要途径,且具有饱和性和优先性的特点。当受体饱和后,非受体介导的内化作用可能在DCs内化HSP70过程中起作用并且呈剂量依赖性。
- 葛伟隋延仿孙玉静曹云新司少艳张秀敏
- 关键词：热休克蛋白质70树突细胞内化
- MAGE1纳米蛋白疫苗的研制及其抗肿瘤效应被引量：2
- 2005年
- 目的制备纳米乳剂包裹基因工程MAGE1(melanoma antigen1)抗原,研究其生物学特性及抗肿瘤免疫效应。方法采用界面聚合法,制备包裹MAGE1抗原的纳米乳剂(NEMAGE1),测量粒径、包裹率、载药量。检测乳剂包裹对小鼠DC摄取抗原能力的影响。用NEMAGE1免疫小鼠,运用酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞毒性杀伤实验(LDH)检测NEMAGE1激活机体细胞免疫反应的状况,并观察纳米蛋白疫苗对荷瘤小鼠的治疗作用。结果成功制备粒径为(15±5)nm的纳米乳剂,包裹率为91%,载药量0.091gPL,4℃放置6个月后性质稳定。DC摄取NEMAGE1的能力明显强于对游离蛋白抗原的摄取。ELISPOT和细胞毒性杀伤实验显示,NEMAGE1可以诱导机体产生针对MAGE1的CTL,特异性杀伤表达MAGE1的肿瘤细胞。荷瘤小鼠的治疗实验显示,NEMAGE1对表达MAGE1的肿瘤有明显疗效,其效果优于单独使用游离MAGE1蛋白。结论纳米乳剂具有较高包裹率和稳定性。纳米乳剂包裹的肿瘤特异性抗原可以有效激活机体产生抗肿瘤免疫效应,是具有临床应用前景的新型抗肿瘤疫苗。
- 孙玉静隋延仿吴道澄葛伟叶菁张秀敏
- 关键词：纳米乳剂肿瘤疫苗
- 兔抗MAGEn血清的制备、纯化及鉴定被引量：2
- 2005年
- 目的: 制备高效价、特异性的兔抗人MAGE-n血清。方法: 对原核表达的MAGE-n蛋白进行纯化, 与弗氏佐剂混合免疫新西兰兔制备抗血清, 用硫酸铵盐析法及溴化氰活化的Sephrose4B(CNBr-ActivatedSephrose4B)亲和层析柱纯化抗血清, 以双向免疫扩散实验、ELISA、Westernblot和免疫组化对兔抗人MAGE-n血清进行鉴定。结果: 经免疫得到高效价的兔抗人MAGE-n血清, 抗血清能够与MAGE-n特异性结合, 免疫组化结果表明MAGE-n是一种胞质蛋白。结论: 用MAGE-n蛋白与弗氏佐剂混合免疫兔, 制备得到高效价的抗血清, 纯化后的特异性兔抗人MAGE-n血清, 为进一步研究MAGE-n在各种组织中的表达奠定了基础。
- 黄亚渝叶菁马加海陈广生宋宏萍隋延仿
- 关键词：抗血清纯化
- 肿瘤抗原MAGE-12新的HLA-A2限制性细胞毒性T细胞表位的预测被引量：4
- 2005年
- 目的 预测黑色素瘤抗原MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位。方法 采用SYFPEITHI超基序远程预测系统与量化基序多项式法、延展基序联合应用,筛选MAGE-12抗原HLA-A0201限制性CTL表位。结果 共预测出5个MAGE-12抗原HLA-A2限制性CTL表位。结论 超基序法与量化基序,延展基序联合应用可以提高预测效率,为实验方法探索MAGE-12的表位提供有用线索。
- 张秀敏隋延仿罗二平黄亚渝曲萍
- 关键词：肿瘤抗原MAGE-12细胞毒性T淋巴细胞表位
- 以CpG-ODN为佐剂的MAGE-n蛋白疫苗的免疫学作用及抗肿瘤效应被引量：2
- 2006年
- 目的制备人黑色素瘤抗原-n(MAGE-n)蛋白疫苗,研究含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)联合MAGE-n蛋白疫苗,诱导小鼠产生的免疫应答,及在肿瘤免疫治疗中的作用。方法对含有MAGE-n原核表达质粒pGEX-MAGE-n的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化,作为MAGE-n蛋白疫苗,人工合成CpG-ODN作为佐剂,以C57BL/6小鼠为实验动物进行免疫接种;采用ELISPOT、LDH释放试验、血清ELISA法检测小鼠的细胞免疫和体液免疫反应;通过观察瘤体积和生存期了解疫苗的抗肿瘤效果。结果联合应用CpG-ODN和纯化的MAGE-n蛋白,能诱发C57BL/6小鼠产生较强的MAGE-n特异性的细胞和体液免疫应答;在MAGE-n阳性的B16肿瘤的免疫治疗中,可以减缓肿瘤的生长速度,延长荷瘤鼠的生存期。结论以CpG-ODN作为佐剂的MAGE-n蛋白疫苗,可以诱导C57BL/6小鼠产生MAGE-n特异性的免疫应答,对荷瘤鼠有较好的抗肿瘤效果,为肿瘤免疫治疗提供了一条新的途径。
- 黄亚渝童卫马加海叶菁陈广生隋延仿
- 关键词：CPG岛寡脱氧核糖核苷酸类
- SEA和B7-1基因真核共表达载体的构建及在B16细胞的表达被引量：13
- 2005年
- 目的构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)和小鼠B71基因真核共表达载体。方法采用PCR和RTPCR方法分别克隆了带B71跨膜区的SEA(SEAB7tm)和小鼠B71基因,中间通过内部核糖体进入位点(Internalribosomeentrysite,IRES)序列的连接克隆至真核表达载体pcDNA3.1+。利用阳离子脂质体将重组质粒转染B16细胞,间接免疫荧光法检测B71和SEA分子在B16细胞膜表面的表达情况。结果测序结果与Genebank中公布的SEA、小鼠B71cDNA序列相符,双标记间接免疫荧光检测结果表明B71、SEA同时在转染的B16细胞膜上表达。结论成功构建了SEA和小鼠B71真核共表达载体,为进一步研究SEA和B71联合应用抗肿瘤免疫治疗及其免疫机理奠定了基础。
- 司少艳隋延仿李增山宋宏萍胡沛臻黄亚渝叶菁陈广生张秀敏
- 关键词：葡萄球菌肠毒素A超抗原真核载体共表达
- 联合表位肽诱导HLA-A2^+人PBMC产生抗原特异性CTL及杀伤活性研究被引量：3
- 2006年
- 目的:探讨MAGE-3,MAGE-n抗原表位体外联合诱导的CTL,并研究其特异性杀伤活性。方法:候选抗原表位以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2+人外周血PBMC,T2细胞负载抗原肽反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,LDH检测其杀伤活性。结果:联合表位肽体外刺激人PBMC,能够较强地诱导抗原特异性CTL并产生特异性杀伤。结论:MAGE-3与MAGE-n的HLA-A2限制性CTL表位肽的联合应用能够产生较强的体外抗肿瘤免疫反应。
- 张秀敏隋延仿司少艳胡沛臻黄杨葛伟李侠马斌
- 关键词：MAGE-3MAGE-N表位
