国家自然科学基金(30271464)
- 作品数：40 被引量：124H指数：7
- 相关作者：隋延仿张秀敏司少艳葛伟胡沛臻更多>>
- 相关机构：第四军医大学第四军医大学西京医院解放军第306医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- MAGE-1与人HSP70融合基因真核表达载体的构建被引量：1
- 2006年
- 目的构建MAGE-1(melanomaantigen1)与人HSP70(heatshockprotein70)融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法利用PCR方法扩增人HSP70基因,经测序后连入真核表达载体pCDNA3.1,再通过PCR方法扩增MAGE-1基因,测序后插入HSP70基因的5'端,构建了MAGE-1与人HSP70融合基因表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70。结果成功地扩增了人HSP70基因与MAGE-1基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致,成功地构建了pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70真核表达载体。结论成功地构建MAGE-1与人HSP70融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70,为进一步DNA肿瘤疫苗研究提供了实验基础。
- 陈广生隋延仿宋宏萍叶菁黄亚渝马加海张秀敏
- 关键词：融合基因
- 肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2004年
- 目的 克隆肿瘤抗原MAGE 3基因 3’端 6 5 7bp片段 ,对其编码的蛋白羧基端 97～ 314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE 3基因全长cDNA的pUC19 MAGE 3质粒中经聚合酶链式反应 (PCR)扩增 3’端 6 5 7bp片段 ,并克隆入pGEX 4T 1载体 ,构建重组原核表达质粒pGEX MAGE 3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 6 6 0bp的条带 ,测序结果表明与GenBank公布的MAGE 3序列一致 ,成功地构建了pGEX MAGE 3原核表达质粒 ,含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基 β D 半乳糖苷 (Isopropyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后表达Mr 为5 4 0 0 0的谷胱甘肽巯基转移酶 (GlutathioneS transferse,GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 2 8%。结论 成功地构建了pGEX MAGE 3原核表达质粒 ,获得了MAGE 3蛋白羧基端 97～ 314aa融合蛋白 ,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。
- 马加海隋延仿叶菁黄亚渝陈广生张秀敏
- 关键词：原核表达聚合酶链式反应
- MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达被引量：5
- 2006年
- 目的:构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体,建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系(humanhepatocellularcarcinomacellline,HHCC)。方法:利用分子生物学方法,构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3,经脂质体法转染HHCC后,用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达,用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3mRNA的表达。结果:成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后,经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3mRNA转录和EGFP的表达。结论:建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC,为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。
- 张秀敏隋延仿司少艳李侠黄杨胡沛臻葛伟
- 关键词：基因转染绿色荧光蛋白
- 树突状细胞表面HSP70受体介导的内化作用被引量：1
- 2006年
- 目的研究树突状细胞(DCs)表面HSP70受体介导的内化作用。方法实验分为3组:HSP70受体封闭组、非受体封闭组和对照组,采用流式细胞仪检测C57BL/6小鼠骨髓来源DCs内化FITC标记的HSP70阳性细胞率。结果受体封闭组50μgHSP70可使DCs表面受体饱和;受体饱和后随HSP70-FITC用量的升高,HSP70-FITC阳性细胞数呈正比性增高;非受体封闭组应用50μgHSP70-FITC与100μgHSP70-FITC时HSP70-FITC阳性细胞率均达到90%以上且组间差别不大。结论DCs表面HSP70受体介导的内化作用是DCs摄取抗原的主要途径,且具有饱和性和优先性的特点。当受体饱和后,非受体介导的内化作用可能在DCs内化HSP70过程中起作用并且呈剂量依赖性。
- 葛伟隋延仿孙玉静曹云新司少艳张秀敏
- 关键词：热休克蛋白质70树突细胞内化
- 以CpG-ODN为佐剂的MAGE-n蛋白疫苗的免疫学作用及抗肿瘤效应被引量：2
- 2006年
- 目的制备人黑色素瘤抗原-n(MAGE-n)蛋白疫苗,研究含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)联合MAGE-n蛋白疫苗,诱导小鼠产生的免疫应答,及在肿瘤免疫治疗中的作用。方法对含有MAGE-n原核表达质粒pGEX-MAGE-n的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化,作为MAGE-n蛋白疫苗,人工合成CpG-ODN作为佐剂,以C57BL/6小鼠为实验动物进行免疫接种;采用ELISPOT、LDH释放试验、血清ELISA法检测小鼠的细胞免疫和体液免疫反应;通过观察瘤体积和生存期了解疫苗的抗肿瘤效果。结果联合应用CpG-ODN和纯化的MAGE-n蛋白,能诱发C57BL/6小鼠产生较强的MAGE-n特异性的细胞和体液免疫应答;在MAGE-n阳性的B16肿瘤的免疫治疗中,可以减缓肿瘤的生长速度,延长荷瘤鼠的生存期。结论以CpG-ODN作为佐剂的MAGE-n蛋白疫苗,可以诱导C57BL/6小鼠产生MAGE-n特异性的免疫应答,对荷瘤鼠有较好的抗肿瘤效果,为肿瘤免疫治疗提供了一条新的途径。
- 黄亚渝童卫马加海叶菁陈广生隋延仿
- 关键词：CPG岛寡脱氧核糖核苷酸类
- SEA和B7-1基因真核共表达载体的构建及在B16细胞的表达被引量：13
- 2005年
- 目的构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)和小鼠B71基因真核共表达载体。方法采用PCR和RTPCR方法分别克隆了带B71跨膜区的SEA(SEAB7tm)和小鼠B71基因,中间通过内部核糖体进入位点(Internalribosomeentrysite,IRES)序列的连接克隆至真核表达载体pcDNA3.1+。利用阳离子脂质体将重组质粒转染B16细胞,间接免疫荧光法检测B71和SEA分子在B16细胞膜表面的表达情况。结果测序结果与Genebank中公布的SEA、小鼠B71cDNA序列相符,双标记间接免疫荧光检测结果表明B71、SEA同时在转染的B16细胞膜上表达。结论成功构建了SEA和小鼠B71真核共表达载体,为进一步研究SEA和B71联合应用抗肿瘤免疫治疗及其免疫机理奠定了基础。
- 司少艳隋延仿李增山宋宏萍胡沛臻黄亚渝叶菁陈广生张秀敏
- 关键词：葡萄球菌肠毒素A超抗原真核载体共表达
- 联合表位肽诱导HLA-A2^+人PBMC产生抗原特异性CTL及杀伤活性研究被引量：3
- 2006年
- 目的:探讨MAGE-3,MAGE-n抗原表位体外联合诱导的CTL,并研究其特异性杀伤活性。方法:候选抗原表位以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2+人外周血PBMC,T2细胞负载抗原肽反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,LDH检测其杀伤活性。结果:联合表位肽体外刺激人PBMC,能够较强地诱导抗原特异性CTL并产生特异性杀伤。结论:MAGE-3与MAGE-n的HLA-A2限制性CTL表位肽的联合应用能够产生较强的体外抗肿瘤免疫反应。
- 张秀敏隋延仿司少艳胡沛臻黄杨葛伟李侠马斌
- 关键词：MAGE-3MAGE-N表位
- 腺病毒介导的肝癌靶向SEA-CD80基因治疗及免疫学机制的初步研究被引量：9
- 2008年
- 目的:观察肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)/CD80基因重组腺病毒载体对肝癌的疗效,并对其免疫学机制进行初步研究。方法:利用AdEasy腺病毒系统分别构建并制备甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子Ⅰ调控的SEA和/或CD80基因重组腺病毒载体,然后采用瘤体内直接注射的方式对小鼠皮下移植性肝癌进行治疗,采用RT-PCR和Western blot方法检测腺病毒注射部位的SEA和CD80 mRNA和蛋白的表达情况;采用ELISpot方法和LDH释放实验分别检测脾脏淋巴细胞中肝癌特异性IFN-γ分泌细胞的频数和细胞毒性T细胞(CTLs)对Hepa1-6细胞的特异杀伤活性;通过观察荷瘤小鼠经治疗后肿瘤体积的变化及生存时间,评价重组腺病毒对肝癌的治疗作用。结果:我们构建的腺病毒能够使SEA和/或CD80 mRNA和蛋白靶向地在肝癌组织中表达;与空载体组和PBS对照组相比,双基因组和单基因组分泌IFN-γ的T细胞数量均明显增多,CTL对Hepa1-6细胞的特异性杀伤作用均明显增强,荷瘤小鼠肿瘤体积明显减小,生存期明显延长;双基因组的疗效和对免疫系统的激活作用明显高于单基因组;CD80和SEA的组之间、空载体和PBS组之间无明显差异。结论:我们制备的肝癌靶向性重组腺病毒对肝癌有良好的治疗作用,联合基因治疗优于单个基因治疗。
- 司少艳胡沛臻黄杨李侠葛伟张秀敏隋延仿张建中张铭
- 关键词：葡萄球菌肠毒素ACD80共表达肝癌
- 表达MAGE-1/HSP70/MAGE-3工程菌的稳定性被引量：1
- 2006年
- 目的检测重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状的稳定性。方法将工程菌菌株连续传50代,每隔10代挑取单克隆菌落进行诱导表达,并计算质粒丢失率。提取不同代次的质粒,扫描电镜观察,检测融合蛋白表达水平,并进行工程菌的染色镜检及生化鉴定。结果pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)融合蛋白工程菌呈典型的大肠杆菌形态,各代次菌的各项检测结果与原始菌种差异无显著意义。结论重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状稳定,可作为生产用菌种。
- 胡沛臻隋延仿李侠张建芳司少艳张秀敏
- 关键词：生物学特性稳定性
- 纳米乳剂的制备及特性鉴定被引量：5
- 2005年
- 目的: 制备包裹BSA- FITC的纳米乳剂 (NEBSA -FITC), 研究其特性以及树突状细胞 (DC)和巨噬细胞对其摄取的效率。方法: 采用界面聚合法, 制备包裹BSA- FITC的纳米乳剂(NEBSA- FITC), 于电镜下观察其形态并测量其粒径。用凝胶层析法检测纳米乳剂的包裹率、载药量及稳定性。将小鼠骨髓DC及腹腔巨噬细胞与NEBSA -FITC共育后, 用流式细胞仪检测DC及腹腔巨噬细胞摄取NEBSA- FITC的阳性率。用激光共聚焦显微镜观察DC摄取NEBSA -FITC的能力。结果: 成功地制备出粒径为(25±10)nm的纳米乳剂, 其包裹率为 91%, 载药量为 0. 091g/L, 于 4℃放置 6个月后性质稳定。流式细胞仪检测显示, DC和腹腔巨噬细胞摄取NEBSA FITC的能力明显强于对游离BSA- FITC的摄取。激光共聚焦显微镜下观察到DC可摄取NEBSA -FITC。结论: 纳米乳剂具有良好的包裹率和载药量, 可有效地增强抗原递呈细胞对所载药物的摄取, 有望作为肿瘤抗原疫苗的新型载体。
- 孙玉静吴道澄曹云新隋延仿
- 关键词：纳米乳剂树突状细胞肿瘤疫苗
