国家自然科学基金(30440069)
- 作品数：3 被引量：12H指数：2
- 相关作者：张志平姜冠潮王俊杨帆周足力更多>>
- 相关机构：北京大学济南市中心医院更多>>
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- 突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响被引量：2
- 2007年
- 目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响。方法:首先构建含有K-rasV12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/siK-rasV12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-rasV12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-rasV12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定。提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-rasV12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Westernblot检测感染前后K-rasV12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-rasV12对人肺腺癌细胞K-rasV12表达的影响。结果:成功构建K-rasV12s iRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-rasV12蛋白的表达。结论:构建的AdH1/siK-rasV12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料。
- 张志平姜冠潮杨帆周足力王俊
- 关键词：SIRNA
- 小分子干扰RNA特异性抑制人胰腺癌细胞株PANC-1突变型K-ras基因表达的探讨被引量：7
- 2006年
- 目的:研究小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)对人胰腺癌细胞株PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用。方法:构建真核表达载体pSilencer3.1-K-rasv12,转染PANC-1细胞后应用RT-PCR及Westernblot检测突变型K-ras基因mRNA及蛋白质表达变化;噻唑蓝(MTT)测定细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功。RT-PCR光密度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:95.3%±2.5%、97.6%±2.8%、40.1%±3.1%,差异有统计学意义(P<0.05);Westernblot灰度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:96.1%±2.2%、98.5%±2.0%、36.5%±3.2%,差异有统计学意义(P<0.05);实验组细胞生长受到明显抑制,凋亡率较对照组明显升高(P<0.05)。结论:pSilencer3.1-K-rasv12能有效抑制突变型K-ras基因在人胰腺癌细胞株PANC-1中的表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡,为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法。
- 张志平姜冠潮王俊
- 关键词：PANC-1细胞
- 靶向突变K-ras基因的小干扰RNA体内外抑制肺癌细胞生长的研究被引量：4
- 2007年
- 目的探讨应用小干扰 RNA(siRNA)敲除突变 K-ras 基因对肺癌细胞 H441体内外生长的抑制作用。方法构建真核表达载体 pSilencer3.1-K-ras^(V12),转染 H441细胞后应用半定量 RT-PCR 及 Western blotting 检测突变 K-ras 基因 mRNA 及蛋白质的表达变化,噻唑蓝法检测 H441细胞增殖速度的变化,流式细胞仪检测 H441细胞凋亡率的变化。裸鼠皮下移植 pSilencer3.1-K-ras^(V12)处理的H441细胞,观察其成瘤性的改变。结果测序证实 pSilencer3.1-K-ras^(V12)真核表达载体构建成功。RT-PCR 灰度比值结果示空载体组、阴性对照组、实验组 K-ras mRNA 相对表达量分别为:93.7%±2.2%、95.1%±2.5%、43.6%±3.1%,差异有统计学意义(F=78,P<0.01);Western blotting 结果示空载体组、阴性对照组、实验组 K-ras 蛋白相对表达量分别为:98.1%±2.4%、97.5%±2.0%、33.5%±3.7%,差异有统计学意义(F=93,P<0.01);经 pSilencer3.1-K-ras^(V12)作用的 H441细胞生长受到明显抑制(P<0.05),凋亡率较对照组明显升高(F=8.9,P<0.01),H441细胞在裸鼠体内生长受到明显抑制。结论靶向突变 K-ras 基因的 siRNA 可以抑制肺癌 H441细胞在体内外的生长速度,诱导细胞凋亡,为肺癌的基因治疗提供了新的思路和方法。
- 张志平姜冠潮杨帆周足力王俊
- 关键词：小干扰
