湖南省重大科技专项(05NK1002)
- 作品数：3 被引量：13H指数：3
- 相关作者：胡春华邓子牛马先锋龙桂友徐磊更多>>
- 相关机构：湖南农业大学国家柑桔品种改良中心更多>>
- 发文基金：湖南省重大科技专项更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 柑橘溃疡病致病基因pthA的克隆及序列分析被引量：6
- 2008年
- 根据pthA基因和溃疡病病菌大质粒序列设计特异性引物,利用long-PCR方法,获得了包括pthA完整编码区及两端部分非编码区在内的约4100bp的DNA片段,再利用net-PCR获得了pthA完整的编码区,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切后将其克隆到植物表达载体pBI121中.经双酶切及核酸序列测定鉴定的阳性克隆重组质粒被命名为pBI-pthA.序列分析结果表明,克隆得到的pthA与登录到Genbank上的pthA序列有99.8%的同源性,pthA全长基因编码1163个氨基酸,具有17.5个102bp单元的重复序列,每个单元编码34个氨基酸,重复区后有1个亮氨酸拉链结构(LZ),3个核定位信号(NLS)序列和C末端酸性转录激活(AAD)保守区.
- 胡春华邓子牛
- 关键词：柑橘溃疡病克隆
- 抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建被引量：4
- 2009年
- 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体(single chain variable fragment,ScFv)基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750bp,其中重链可变区(VH)基因有360bp,轻链可变区(VL)基因有342bp,中间连接肽基因45bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质[0]的研究打下了基础。
- 胡春华龙桂友戴素明马先锋谢玉明李娜邓子牛
- 关键词：柑橘溃疡病单克隆抗体单链抗体
- 柑橘无毒化技术研究进展
- 柑橘病毒类病害的危害日趋严重,已成为发展柑橘生产的严重障碍,各国对病害的研究和防治极为重视。目前主要采用脱毒技术以获得脱毒苗,包括珠心培养、热处理、茎尖培养、茎尖嫁接等。对现有柑橘脱毒技术进行了综述及比较,了解到茎尖嫁接...
- 杨莉张家银郭琛韩健邓子牛
- 关键词：柑橘脱毒技术
- 文献传递
- 柑橘溃疡病致病基因pthA核定位信号肽抗血清的制备及其抑菌研究被引量：6
- 2008年
- 用PCR法扩增位于柑橘溃疡病菌致病基因pthAC-末端的3个核定位信号序列,并将其克隆到原核表达载体PET32a(+)上,经双酶切及核酸序列测定重组质粒(pthA-NLS),其序列与GenBank中pthA的相关序列有99.9%的同一性。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导了重组多肽的表达,并用Ni2+-NTA纯化柱得到了48kD的纯化重组多肽。把重组多肽注入免疫Balb/c小白鼠,制备了相应的抗血清,Western blotting和ELISA分析结果表明,抗血清可特异地结合重组多肽,亦可识别溃疡病菌PthA天然蛋白,获得的抗血清可以用于柑橘溃疡病的检测。利用抗血清与溃疡病菌混合接种离体冰糖橙叶片,发现抗血清能推迟溃疡病菌的致病过程,且病斑比对照小,但未能达到抗病程度。pthA基因末端核定位信号序列的克隆、原核表达及抗血清的制备为进一步研究pthA的致病机理和研发溃疡病快速分子检测技术奠定了基础。
- 胡春华徐磊马先锋龙桂友刘昆玉邓子牛
- 关键词：柑橘溃疡病抗血清
- 抗PthA核定位信号肽单克隆抗体单链抗体基因的克隆及原核表达
- 从分泌抗pthA核定位信号肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10H2中提取总RNA,采用RT-PCR,逆转录合成单链cDNA作为模板,用小鼠重链可变区和轻链可变区通用引物,克隆抗体可变区基因。在重链可变区和轻链可变区基因上加...
- 胡春华马先锋邓子牛
- 关键词：柑橘溃疡病单链抗体
- 文献传递
