国家自然科学基金(30772524)
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
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- 重叠延伸PCR定点诱变技术纠正SEA基因中的点突变
- 2010年
- 目的纠正金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxixsA,SEA)基因中的点突变。方法以携带突变SEA基因的重组载体pLXSN-SEP为模板,采用重叠延伸PCR定点诱变技术,对SEA基因中第133位点碱基点突变(A→G)进行纠正,并构建真核表达载体pcDNA3.1-SEA及测序。结果突变的SEA基因第133位点碱基已由G纠正为A,SEA基因序列与Gene-Bank中公布的序列完全一致。结论重叠延伸PCR定点诱变技术高效、简便,可使SEA基因中突变位点得到纠正;载体pcDNA3.1-SEA的成功构建,为进一步应用SEA基因进行肿瘤基因治疗奠定了基础。
- 司少艳宋淑军张建中刘俊丽张铭路浩军
- 关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素A基因位点突变
- mTERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达研究被引量：4
- 2011年
- [目的]构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6、结肠癌细胞CT26、黑色素瘤细胞B16和成纤维细胞NIH3T3中的表达情况。[方法]采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,转化Ad293细胞制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染上述四种细胞。采用免疫荧光染色法及流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。[结果]以感染复数为100病毒量感染上述细胞后,CD80和SEA的不同肿瘤细胞上表达率不同,而病毒感染的NIH3T3细胞不表达SEA和CD80。[结论]成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在不同肿瘤细胞中的靶向表达,但表达效率有所不同。为进一步采用同一腺病毒对不同肿瘤细胞的进行靶向基因治疗研究奠定了基础。
- 司少艳徐冰心宋淑军史亮赵刚刘俊丽刘志国张建中
- 关键词：葡萄球菌肠毒素ACD80腺病毒
- 应用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术筛选正常和肝癌小鼠血清差异蛋白被引量：2
- 2009年
- [目的]应用蛋白质芯片及表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术筛选正常和肝癌小鼠血清差异蛋白。[方法]采用小鼠肝癌细胞株Hepa1-6建立小鼠肝癌模型,分别于接种肝癌细胞后5d、10d、20d处死小鼠,测量肿瘤体积,分离血清,采用弱阳离子蛋白质芯片CM10及SELDI-TOF-MS技术,对正常和肝癌小鼠血清进行蛋白质谱分析。采用BioMarker Wizard软件分析差异蛋白,并经数据库搜索分子量接近的蛋白。[结果]质谱分析共检测出181个蛋白峰,获得13个差异蛋白,其中6个蛋白在肝癌模型小鼠血清中高表达,随肿瘤体积的增大而逐渐升高,7个蛋白在肝癌模型小鼠血清中低表达,随肿瘤体积的增大而逐渐降低。经蛋白质数据库搜索,有14个蛋白的分子量与这些差异蛋白的分子量最为接近。[结论]检测到的13个差异蛋白质可能是肝癌血清特异性生物标志物。
- 司少艳张军杨鹤鸣冯凯郑燕华张铭陆浩君吴继华景青萍
- 关键词：生物学标志表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱蛋白芯片
- mTERT启动子调控SEA/CD80基因治疗小鼠肝癌被引量：1
- 2012年
- 目的观察我们以前构建的端粒酶反转录酶启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)/CD80基因重组腺病毒载体对肝癌的疗效和诱导的免疫学效应。方法重组腺病毒采用瘤体内直接注射的方式对小鼠皮下移植性肝癌进行治疗,采用RT-PCR和Western blot方法检测腺病毒注射部位的SEA和CD80 mRNA和蛋白的表达情况;采用ELISpot方法和LDH释放实验分别检测脾脏淋巴细胞中肝癌特异性IFN-γ分泌细胞的频数和细胞毒性T细胞(CTLs)对Hepa1-6细胞的特异杀伤活性;通过观察荷瘤小鼠经治疗后肿瘤体积的变化及生存时间,评价重组腺病毒对肝癌的治疗作用。结果我们构建的腺病毒能够使SEA和/或CD80mRNA和蛋白靶向地在肝癌组织中表达;与空载体组和PBS对照组相比,双基因组和单基因组分泌IFN-γ的T细胞数量均明显增多,CTL对Hepa1-6细胞的特异性杀伤作用均明显增强,荷瘤小鼠肿瘤体积明显减小,生存期明显延长;双基因组的疗效和对免疫系统的激活作用明显高于单基因组。结论我们制备的肿瘤靶向性重组腺病毒对肝癌有良好的治疗作用,联合基因治疗优于单个基因治疗。
- 司少艳宋淑军史亮刘俊丽谭小青刘昌叶张建中
- 关键词：葡萄球菌肠毒素ACD80腺病毒肝癌
- 小鼠TERT启动子的克隆及在肿瘤细胞中的转录活性研究被引量：4
- 2010年
- 目的:克隆不同长度的小鼠端粒酶逆转录酶(mouse telomerase reverse transcriptase,mTERT)启动子,研究其在小鼠肝癌细胞Hepa1-6、结肠癌细胞CT26、恶性黑色素瘤细胞B16和小鼠成纤维细胞NIH3T3中的转录活性。方法:以Hepa1-6细胞的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增不同长度的mTERT启动子片段,分别命名为mTERT1至7;然后分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建真核表达载体;采用脂质体Lipofectamine2000将重组质粒分别和pRL-CMV共转染Hepa1-6、CT26、B16和NIH3T3细胞,采用双荧光素酶法检测不同长度的mTERT启动子片断在细胞中的转录活性。结果:双酶切和测序鉴定均显示不同长度的mTERT启动子克隆成功及其表达载体构建成功;荧光素酶活性检测显示mTERT1至5在3种肿瘤细胞中有较高的转录活性,而在NIH3T3细胞中的活性较低,mTERT6和mTERT7在所有细胞中均很低;同一片断在不同肿瘤细胞株中活性不同。结论:mTERT核心启动子区位于ATG上游333bp内,且具有肿瘤特异性。
- 司少艳梁爽宋淑军冯凯刘俊丽张军路浩君张铭
- 关键词：靶向基因治疗肿瘤
- 携带SEA和CD80双基因的重组腺病毒转染B16细胞体外诱导T淋巴细胞活化的研究
- 2015年
- 目的:观察恶性黑色素瘤B16细胞经重组腺病毒感染后,表达在B16细胞膜上的SEA和CD80体外能否诱导免疫学反应。方法:B16细胞分别经空载体腺病毒Ad(空)和重组腺病毒Ad-MMRE-m TERTB7、Ad-MMRE-m TERT-SEA、Ad-MMRE-m TERT-BIS感染后,和小鼠脾淋巴细胞共培养,然后,采用Brdu酶联免疫法(ELISA)检测淋巴细胞增殖;流式细胞术检测T淋巴细胞亚群增殖;ELISA法检测细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的产生。结果:与感染空载体腺病毒Ad(空)和未感染B16细胞相比,经重组腺病毒感染的B16细胞体外能够显著诱导脾淋巴细胞的增殖,其中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞增殖显著;细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2的产生显著升高;CTLs对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强;表达双基因的B16细胞体外诱导免疫应答的能力高于单基因过表达B16细胞。结论:B16细胞经重组腺病毒感染后,表达在细胞膜上的SEA和CD80具有免疫学活性,本研究为今后进一步采用所构建重组腺病毒进行恶性黑色素瘤的免疫基因治疗提供了实验依据。
- 司少艳刘俊丽徐冰心化楠秦亚亚刘昌叶宋淑军
- 关键词：CD80恶性黑色素瘤免疫基因治疗
- 小鼠TERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的:构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中的表达情况。方法:采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染肝癌细胞系Hepa1-6和成纤维细胞系NIH3T3。采用免疫荧光染色法检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。结果:重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS感染的Hepa1-6肝癌细胞膜上能够共表达SEA和CD80;而病毒感染的NIH3T3细胞不能表达SEA和CD80。结论:成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在肝癌细胞中的靶向表达,为进一步研究肝癌的靶向基因治疗奠定了基础。
- 司少艳宋淑军徐冰心赵刚谭小青刘俊丽张建中刘志国
- 关键词：葡萄球菌肠毒素ACD80腺病毒
