国家自然科学基金(30271265)
- 作品数：9 被引量：18H指数：3
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- 同时携带人血管内皮生长因子和血管生成素基因的内皮祖细胞血管再生研究
- 2007年
- 目的用腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体将人血管内皮生长因子165 （vascular endothelial growth factors,VEGF165）和血管生成素-1（angiopoietin-1,Angl）基因同时转入骨髓源性内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）中,观察外源基因的表达并评价其促血管再生的能力。方法用同时携带人VEGF165和Angl基因的AAV载体AAV2-hAngl/VEGF165转染体外培养的兔骨髓源EPCs,用RT-PCR和细胞免疫化学法检测外源基因的表达。实验用新西兰大白兔24只,制作成右下肢缺血模型,随机分成3组：PBS、EPC和EPC/AV组。造模后第10天,向缺血肌组织中分别注射PBS、EPCs和AAV2-hAngl/VEGF165转染的EPCs,用免疫组织化学法评价其血管再生效应。结果EPCs可高效地被AAV2-hAngl/VEGF165转染而表达Angl和VEGF165。细胞移植4周后,EPC/AV组存活的EPCs密度（283±137）/mm^-2明显高于EPC组（191±88）/mm^-2;EPC/AV组的毛细血管密度（856±212）/mm^-2明显高于EPC组（564±177/mm^-2）和PBS组（308±112）/mm^-2;α-SMA阳性血管密度（6.9±3.0）/mm^-2明显高于PBS组（3.6±1.8）/mm^-2,P〈0.05。结论AAV载体可同时将人VEGF165和Angl基因转入EPCs中,转染后的EPCs具有更强的促血管再生能力。
- 陈锋谭最董长垣谢友利吴云陈晓郭淑芳
- 关键词：血管内皮生长因子类血管生成素1腺相关病毒内皮祖细胞
- 腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与内皮祖细胞联合治疗肢体缺血被引量：3
- 2007年
- 目的探讨腺相关病毒（AAV）介导的人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染的兔骨髓内皮祖细胞（EPCs）自体移植对于移植细胞存活率和缺血肢体血管再生的影响。方法构建、制备携带hVEGF165基因或β-半乳糖苷酶（β-gal）基因的AAV载体AAV-hVEGF165和AAV-LacZ；用AAV-hVEGF165和AAV-LacZ分别转染体外培养的EPCs，得到AAV／VEGF-EPC和AAV／LacZ-EPC，用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术检测外源基因的表达。分别用AAV／VEGF-EPC、AAV／LacZ-EPC和PBS自体移植于兔右下肢缺血的肌组织，28d后行双侧肢体血流和免疫组织化学检测。结果AAV／VEGF-EPC和AAV／LacZ-EPC内可检测到外源基因的表达。AAV／VEGF-EPC、AAV／LacZ-EPC和PBS组患／健侧血流比值、毛细血管密度分别为0．73±0．21、0.64±0．13、0．45±0．10；（962±291）、（557±132）、（361±69）／mm^2。AAV／VEGF-EPC和AAV／LacZ-EPC组移植成活的EPCs密度分别为（330±81）／mm^2和（204±55）／mm^2。结论AAV能够高效将外源基因转入EPCs，对其进行基因修饰。自体移植从V-hVEGF165酤转染的EPCs可提高其移植存活率和增强其促进缺血肢体血管再生能力。
- 陈锋谭最董长垣陈晓郭淑芳
- 关键词：腺相关病毒内皮细胞血管内皮生长因子缺血
- 体外诱导兔骨髓单个核细胞向血管内皮细胞分化的研究被引量：5
- 2005年
- 目的 :研究体外培养兔骨髓单个核细胞 (bonemarrowmononuclearcells,BM MNCs)诱导分化为内皮系细胞。方法 :穿刺抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心与免疫磁珠法富集的BM MNCs ,于内皮细胞条件培养基 (endothelialgrowthmedium ,EGM )中培养 2月 ,观察细胞的贴壁情况、形态变化及其血管内皮细胞特异性标志的表达。 结果 :培养第 3d开始出现梭形贴壁细胞 ,约第 7d出现团状聚集细胞集落 ;第 7～ 10d的贴壁细胞表达vWF、CD31,摄取acLDL ,分泌NO。贴壁细胞传代培养 10代后接近融合 ,细胞扩增了约 10 0 0倍。结论 :在一定条件下 ,体外培养BM MNCs可增殖诱导分化得到内皮系细胞。
- 艾鹏谭最董长垣陈晓
- 关键词：骨髓单个核细胞内皮细胞分化体外培养
- 人血管生成素1和VEGF基因腺相关病毒共表达系统的构建
- 2004年
- 目的 :建立一个可同时表达人血管生成素 1(Angiopoietin 1)和血管内皮生长因子 16 5 (VEGF16 5 )的重组腺相关病毒 (AAV)载体基因转移系统 ,为下一步的研究做准备工作。方法 :利用PCR技术 ,获取目的基因Angiopoietin1和VEGF16 5 ,Angiopoietin 1的上游含有HindⅢ位点 ,下游含有BamHⅠ位点 ,VEGF16 5的上游含有BglⅡ位点 ,下游含有BamHⅠ位点。通过重组DNA技术 ,利用过渡质粒pZero 中含有的BamHⅠ、BglⅡ、HindⅢ、NotⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、BspHⅠ、KspⅠ酶切位点以及pAAV MCS中含有的相应粘端互补的酶切位点 ,将Angiopoietin 1和VEGF16 5亚克隆进入pAAV MCS。结果 :测序证实Angiopoietin 1和VEGF16 5与GeneBank提供的原始序列完全一致。酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致。在新的重组质粒中 ,Angiopoietin 1和VEGF16 5各有一套CMV启动子和PolyA终止子系统。结论 :Angiopoietin 1和VEGF基因AAV共表达系统的构建成功 ,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。
- 陈德杰谭最谢友利刘芳
- 关键词：血管生成素腺相关病毒载体
- 腺相关病毒介导的人血管内皮生长因子体外转染兔骨髓内皮祖细胞被引量：1
- 2007年
- 目的:探讨腺相关病毒-2(AAV-2)介导人血管内皮生长因子-165(hVEGF165)转染兔骨髓内皮祖细胞(EPCs)及其对EPCs增殖能力的影响。方法:构建携带hVEGF165基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体pAAV-hVEGF165;制备携带hVEGF165基因的rAAV(rAAV-2-hVEGF165)和携带β-半乳糖苷酶(-βgal)基因的rAAV(rAAV-2-LacZ);体外培养和鉴定兔骨髓EPCs;分别用rAAV-2-hVEGF165和rAAV-2-LacZ体外转染EPCs(AAV/VEGF-EPC和AAV/LacZ-EPC);用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术等法检测hVEGF165和-βgal的表达,MTT法检测AAV/VEGF-EPC的增殖能力。结果:经酶切鉴定和DNA测序,得到了序列正确的重组质粒pAAV-hVEGF165;AAV/VEGF-EPC能够表达hVEGF165蛋白,AAV/LacZ-EPC能够表达-βgal;rAAV-2-hVEGF165对于EPCs的转染率为64.4%;AAV/VEGF-EPC的增殖能力明显强于AAV/LacZ-EPC和EPCs。结论:EPCs可以被rAAV-2-hVEGF165高效转染,其增殖能力明显增强。本文为进一步探讨AAV/VEGF-EPC用于缺血性血管疾病治疗的可能性奠定了基础。
- 陈锋谭最董长垣陈晓郭淑芳
- 关键词：腺相关病毒内皮祖细胞血管内皮生长因子Β-半乳糖苷酶
- 腺相关病毒rAAV-LacZ转导体外培养的骨髓内皮祖细胞
- 2005年
- 目的:研究表达β-半乳糖苷酶的重组腺相关病毒(rAAV-LacZ)对于体外培养的骨髓内皮祖细胞(EPCs)的转导效率.方法:将pAAV-LacZ、pAAV-helper、pAAV-RC用磷酸钙法共转染HEK293细胞,得到rAAV-LacZ;用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提法浓缩纯化病毒;用AVSachTM ELISA法rAAV2颗粒滴度测定试剂盒测定rAAV-LacZ的滴度;用不同MOI值(1.0×104 ～1.0×106v·g/cell)的病毒感染EPCs,48 h后,用β-Gal ELISA试剂盒测定β-半乳糖苷酶的表达,原位β-gal染色试剂盒染色,根据蓝染的阳性细胞占细胞总数的比率来估计rAAV-LacZ对于EPCs的转导效率.结果:rAAV-LacZ的滴度为9.6×1012v·g·ml-1;rAAV-LacZ对于EPCs的转导率约为60%,当MOI增加到106v·g/cell时,β-Gal的表达量增至(31.40±2.51)ng·mg· protein-1.结论:rAAV-LacZ能够有效的转导EPCs,这为AAV载体应用于细胞生长因子与EPCs联合治疗缺血性血管疾病提供实验基础.
- 陈锋谭最董长垣陈晓郭淑芳
- 关键词：腺相关病毒内皮祖细胞Β-半乳糖苷酶
- 促血管生成素在机体血管形成过程中的作用被引量：5
- 2005年
- 促血管生成素 (angiopoietins,Ang)及其受体Tie2系统是调控血管完整性的重要因子 ,并参于生理及病理性血管生成 ,Ang1促进血管成熟与稳定 ,并维持血管的完整性。在内源性血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor ,VEGF)作用存在时 ,Ang2可增加毛细管管径、重建基膜、促EC增生与迁移 ,刺激新生血管出芽 ,而当内源性VEGF作用受抑制时Ang2加速内皮细胞死亡及血管退行性变。推测使用Ang、VEGF联合用于治疗性血管生成可能使新生血管获得持久稳定的结构 ,达到更理想的远期疗效。
- 艾鹏谭最
- 关键词：促血管生成素机体血管形成
- 携带人VEGF165、Ang1基因的AAV-2促血管新生研究
- 2018年
- 目的:通过观测携带人血管内皮生长因子-165(vascular endothelial growth factor,VEGF165)和血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang1)基因的重组腺相关病毒-2(adeno-associated virus,AAV-2)对兔肌组织的生物学效应,探讨其促进血管再生的能力。方法:选取雄性新西兰大白兔32只,随机分为四组,每组各8只。用携带人VEGF165基因的病毒载体AAV-2-hVEGF165、携带人Ang1基因的病毒载体AAV-2-hAng1、携带-半乳糖苷酶(-gal)基因的rAAV-2-LacZ同时携带人Ang1/VEGF165基因的病毒载体AAV-2-hAng1/VEGF165直接注射新西兰雄性大白兔肌组织中,4周后利用肉眼观察和免疫组织化学染色法检测它们的血管再生效应。结果:注射AAV-2-hAng1/VEGF165的肌组织内再生的血管丰富密集且管径粗大,明显优于AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1、AAV-2-LacZ的血管再生效应。结论:同时携带人Ang1、VEGF16两种基因的AAV-2在肌组织中发挥最强的血管再生效应,单独携带人Ang1、VEGF16两种基因的AAV-2在肌组织也具有促进血管再生效应。AAV-2-hAng1/VEGF165不但可促进缺血肢体的血管生成、动脉生成、血流量的恢复,并且可降低血管的通透性,其疗效优于AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1、AAV-2-LacZ的单独应用。
- 蔡冠军谭最章长杰
- 关键词：血管生成素1血管内皮生长因子腺相关病毒血管新生
