国家自然科学基金(30571669)
- 作品数：7 被引量：14H指数：3
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- 相关机构：上海交通大学附属第六人民医院更多>>
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- 树突状细胞在乙型肝炎病毒感染中的作用被引量：4
- 2009年
- 陈小华臧国庆
- 关键词：树突状细胞乙型肝炎病毒感染机体免疫反应免疫耐受抗原提呈T细胞分化
- 转录反式激活蛋白转导域介导HBcAg穿透细胞膜的作用被引量：7
- 2008年
- 目的观察蛋白转导域（PTD）-HBcAg融合蛋白的细胞膜穿透作用。方法合成转录反式激活蛋白（Tat）-PTD编码序列，PCR技术扩增HBcAg全长基因，通过重叠延伸PCR片段拼接法将Tat—PTD编码序列和HBcAg全长基因融合，将融合基因克隆到pMAL-c2X原核表达载体中。挑选测序正确的构建质粒，转化大肠埃希菌Rosetta—gami^TM2（DE3），异丙基-β—D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达，Western印迹鉴定，亲和层析纯化融合蛋白PTD-HBcAg，同样方法得到HBcAg蛋白作为对照。纯化蛋白加入细胞培养介质中，间接免疫荧光检测进入细胞内的PTD-HBcAg和HBcAg。结果大肠埃希菌中过度表达的融合蛋白可通过亲和层析纯化，Western印迹证实纯化的PTD-HBcAg和HBcAg能被HBcAg单克隆抗体识别，细胞免疫荧光检测证实PTD-HBcAg可跨膜转导入细胞内，而单独的HBcAg未能在细胞内检测到。结论融合蛋白PTD-HBcAg可在原核表达系统中高效表达、分离纯化，PTD能介导HBcAg穿透细胞膜进入细胞。
- 潘庆春臧国庆余永胜汤正好张韡韩进超
- 关键词：反式激活因子类细胞膜
- PTD—HBcAg体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用被引量：2
- 2009年
- 目的观察融合蛋白PTD-HBcAg诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞（DC）成熟及对T淋巴细胞增殖的作用。方法体外分离培养近交系BALB／c小鼠髓源性DC，加入重组粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（rGM-CSF）、重组IL4培养5d，再加入TNF-a、HBcAg和PTD-HBcAg诱导DC成熟。激光共聚焦显微镜观察免疫荧光在细胞中的分布及定位，流式细胞计数仪测定DC表面分子表达，ELISA法测定DC培养上清液中IL-12p70的水平，CCK8试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应。组间数据比较采用t检验。结果成功体外诱导培养小鼠髓源性DC，HBcAg主要定位于DC膜表面，而PTD-HBcAg能够穿透DC膜进入细胞质。PTD-HBcAg能明显上调DC表面分子CD80、CD86和主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子表达；50mg／L和100mg／LPTD-HBcAg诱导DC分泌IL-12p70水平分别为（142．50±18．31）ng／L和（124．30±15．12）ng／L，明显高于HBcAg诱导组的（42．31±4．21）ng／L（t=9．234和9．045，均P〈O．05）；PTD-HBcAg诱导DC刺激T淋巴细胞增殖能力明显高于HBcAg组及阳性对照TNF-α组。结论PTD-HBcAg具有穿透IX；膜能力，并能促进DC分化、成熟，明显上调表面共刺激分子表达，增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及分泌Ib-2p70的水平。
- 陈小华潘庆春余永胜韩进超臧国庆
- 关键词：肝炎核心抗原抗原呈递淋巴细胞活化膜渗透
- PTD-HBcAg融合蛋白诱导HBV特异性免疫反应的研究
- 2009年
- 目的观察PTD-HBcAg融合蛋白免疫BALB/c小鼠后的体液免疫与细胞免疫效果。方法目的蛋白(PTD-HBcAg)、阳性对照蛋白(HBcAg)和阴性对照分别与等体积的弗氏完全佐剂乳化免疫小鼠,第21天以不完全弗氏佐剂乳化同法加强免疫,第28天ELISA法检测HBcAb滴度,流式细胞仪检测HBV特异性IFN-γ+、CD8+T淋巴细胞水平。结果PTD-HBcAg融合蛋白能够诱导产生较高水平HBcAb;与阳性蛋白对照组[(1.45±0.19)%,(2.19±0.04)%和(4.32±1.04)%]和阴性对照组相比,PTD-HBcAg融合蛋白组[(2.64±0.21)%,(3.50±0.50)%和(6.85±1.3)%]诱导的HBV特异性CD8+T淋巴细胞水平明显增高(P<0.05)。结论PTD-HBcAg融合蛋白具有体液免疫与细胞免疫效果,为治疗性乙肝疫苗的开发提供了一定的实验基础。
- 赖静兰陈小华潘庆春臧国庆
- 关键词：融合蛋白细胞免疫体液免疫
- PTD-HBcAg融合蛋白诱导特异性CTL在HepG2.2.15细胞抑制HBV复制的研究
- 2010年
- 目的探讨PTD-HBcAg融合蛋白诱导小鼠体内特异性CTL并抑制HepG2.2.15细胞HBV复制的作用。方法 PTD-HBcAg、HBcAg和阴性对照分别与等体积的弗氏佐剂乳化后皮下免疫小鼠;第14d,分离脾淋巴细胞并分别用PTD-HBcAg、HBcAg、PTD和PBS加强刺激后收集上清,检测细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10;刺激后的淋巴细胞作为效应细胞与HepG2.2.15细胞共培养,检测,效应细胞对HBsAg、HBVDNA的抑制作用及对HepG2.2.15细胞、HepG2细胞的杀伤效果。结果 PTD-HBcAg组分泌的IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10与HBcAg组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);PTD-HBcAg融合蛋白组较HBcAg组和阴性对照组有更明显的病毒抑制作用(P<0.05);PTD-HBcAg组对HepG2.2.15细胞的杀伤率明显高于HBcAg组和阴性对照组(P<0.05)。结论 PTD-HBcAg可诱导HBV特异性CTL,能有效抑制HepG2.2.15细胞HBV的复制。
- 赖静兰陈小华潘庆春臧国庆
- 关键词：HEPG2.2.15细胞细胞毒性T淋巴细胞
- PTD-HBcAg融合蛋白经树突状细胞诱导特异性CTL抑制HBV的体外研究被引量：4
- 2009年
- 目的:探讨经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的树突状细胞(DCs)体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTLs)对HBV的抑制作用。方法:体外分离培养小鼠髓源性DC,加入融合蛋白刺激DC成熟后与T淋巴细胞共培养,ELISA法检测T淋巴细胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和INF-γ的分泌水平,流式细胞术检测胞内细胞因子水平,乳酸脱氢酶释放试验检测特异性CTL活性,并对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg及HBV DNA水平进行检测。结果:经不同融合蛋白刺激的DCs能有效促进T淋巴细胞的细胞因子分泌,同时融合蛋白PTD-HBcAg组中IL-2(552.7±117.5ng/L)和INF-γ(150.6±7.945ng/L)明显高于HBcAg组中IL-2(420±12.47ng/L)和INF-γ(107.5±12.19ng/L)分泌。流式细胞计数术检测的PTD-HBcAg融合蛋白诱导CTL细胞水平明显高于对照组。经PTD-HBcAg融合蛋白诱导的CTL比HBcAg有明显的特异性杀伤作用(P<0.05),同时对HBsAg及HBV DNA水平有明显的抑制作用。结论:经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的DCs能有效刺激T淋巴细胞分泌细胞因子及增加细胞毒T淋巴细胞的表达,并增强特异性CTL活性及对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg及HBV DNA水平的抑制。
- 陈小华潘庆春余永胜汤正好臧国庆
- 关键词：融合蛋白特异性CTL
- Tat_(47-57)-HBcAg融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达鉴定被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨融合蛋白Tat47-57-HBcAg原核表达的可行性,并分析其表达形式,为研究其功能提供理论基础。方法:合成Tat47-57编码序列,PCR技术扩增HBcAg基因,通过重叠延伸PCR片段拼接法,将Tat47-57编码序列和HBcAg基因拼接,将融合基因克隆到pET28原核表达载体中。挑选测序正确的构建质粒转化大肠埃希菌Rosetta-gamiTM2(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达,表达产物超声破壁,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白的表达形式,Western印迹鉴定。结果:Tat47-57-HBcAg融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性形式过度表达,Western印迹分析表明Tat47-57-HBcAg融合蛋白可与HBcAg单克隆抗体反应。结论:融合蛋白Tat47-57-HBcAg以可溶性形式在原核表达系统中高效表达,并能特异性的被HBcAg单克隆抗体所识别。
- 潘庆春余永胜汤正好张韡韩进超臧国庆
- 关键词：乙型肝炎核心抗原融合基因重组融合蛋白质类基因表达
