甘肃省高层次人才科技创新创业扶持行动项目
- 作品数：18 被引量：29H指数：3
- 相关作者：郑海学杨帆曹伟军刘华南朱启运更多>>
- 相关机构：中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃农业大学安徽农业大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金甘肃省科技重大专项计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 新型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株全长cDNA克隆的构建与分析
- 2013年
- 为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株(EF635006)和经典CH-1a株(AY032626)全基因组序列设计并合成特异引物,进而用RT-PCR分6段扩增了HP-PRRSV弱毒株的全基因组。将扩增的各个cDNA重叠片段分别克隆到pMD20-T载体中,建立了PRRSV弱毒株的初级cDNA克隆,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择特异的酶切位点,将各个亚克隆产物逐段亚克隆入经过改造的低拷贝pOK12载体中,通过引入MluⅠ和EcoRⅠ酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ和T7启动子序列及榔头锤酶基因置于病毒基因组的5′端,引入NotⅠ和FseⅠ将聚合酶Ⅱ、Ⅰ终止子序列及戊型肝炎病毒核酶基因置于病毒基因组的3′端,结果得到了病毒基因组全长cDNA克隆ppAPRRSVOK12。测序结果表明,该毒株基因组全长15 319bp[不包括poly(A)尾];全基因序列比对结果显示,该毒株属于北美洲型毒株,与HuN4的同源性高达99.5%。测序及酶切鉴定结果证实,HP-PRRSV弱毒株基因组全长cDNA克隆已构建成功。
- 王松豪郑海学杨帆曹伟军刘芳张艳刘华南郭建宏
- 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性分子克隆
- 固有免疫学的研究进展及其对研制新型免疫佐剂的启示被引量：1
- 2011年
- 近年来,亚单位疫苗、DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗不断涌现,这些疫苗纯度高、特异性强。但其分子小,免疫原性较差,难以诱导机体产生有效的免疫应答,需添加佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答。免疫学的研究阐明了固有免疫如何调节适应性免疫。随着固有免疫学的发展和生化技术的提高,开发特异性更强、生物安全性更高的免疫佐剂越来越受到重视。对佐剂的分类、作用机理,固有免疫学的研究进展进行了综述,并就未来发展趋势提出自己的观点,为临床应用和进一步研制高效、低毒的免疫佐剂提供了参考。
- 孙英军张艳吴琼郑海学张志东
- 关键词：免疫佐剂TLR固有免疫疫苗
- 抗口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备和鉴定
- 2013年
- 以重组A型口蹄疫病毒(FMDV)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并通过间接ELISA、有限稀释法及Western-blotting等试验进行筛选及鉴定。结果显示,获得了1株能够持续稳定分泌抗FMDV 3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为5G2);经鉴定染色体数介于102～106条之间,与预期结果相符;单克隆抗体的稳定性检测表明其细胞培养上清抗体效价为1∶1 280,腹水抗体效价为1∶25 600,说明该株单克隆抗体的性质比较稳定;单克隆抗体特异性试验结果显示,获得的腹水单抗与3D蛋白、重组A型FMDV、A型FMDV、Asia1型FMDV及O型FMDV均可发生特异性反应,而与猪水疱病病毒及水疱性口炎病毒不发生反应。该非结构蛋白3D单克隆抗体的成功制备为进一步利用该单抗开发诊断试剂和研究病毒基因功能提供了技术手段。
- 杨华杨帆闫银银曹伟军吕律张荣刘华南杨波杨孝朴郑海学
- 关键词：口蹄疫病毒单克隆抗体
- 口蹄疫病毒VP1蛋白诱导犊牛甲状腺初代细胞凋亡的鉴定
- 2014年
- 为了制备和培养犊牛甲状腺初代细胞(CTY),并检测口蹄疫病毒VP1蛋白对其诱导的凋亡情况,采用原代细胞培养方法,取初生犊牛甲状腺制备初代细胞并培养。采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,再用限制性内切酶EcoRⅠ+XhoⅠ酶切后定向克隆到表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-VP1,转染CTY,用Western-blot检测口蹄疫病毒VP1蛋白在犊牛甲状腺初代细胞中的表达情况;通过显微镜观察转染的CTY细胞状态、经AV-PI双染色、检测线粒体膜电位变化和Hoechst-33258荧光染色来检测细胞凋亡。结果显示,成功制备了犊牛甲状腺初代细胞,构建的重组质粒可以在犊牛甲状腺初代细胞中表达,通过几种方法均证明口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导犊牛甲状腺初代细胞的凋亡,细胞凋亡率比空载体对照组高约2倍。结果表明,口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导CTY的凋亡,这一结果为深入研究口蹄疫病毒VP1蛋白凋亡功能域和VP1诱导的凋亡途径奠定了基础。
- 李营营毛箬青杨帆曹伟军郑海学张淼涛
- 关键词：VP1蛋白细胞凋亡
- 口蹄疫病毒O型Mya98谱系猪源毒株和牛源毒株全基因组的比较被引量：2
- 2014年
- 为了查明我国新流行的口蹄疫病毒(FMDV)O型Mya98谱系猪源和牛源毒株的序列差异,采用RT-PCR方法,对FMDV O型Mya98谱系牛源毒株(O/BY/CHA/2010)和猪源毒株(O/GZ/CHA/2010)的基因组全序列进行了扩增和测序,并与O型其他牛源和猪源参考毒株的基因组进行了比较分析。结果显示,O/BY/CHA/2010毒株和O/GZ/CHA/2010毒株都属于SEA拓扑型的Mya98谱系毒株。O/BY/CHA/2010毒株和O/GZ/CHA/2010毒株与来自Mya98谱系的其他毒株的全基因的核苷酸同源性大于98.0%。除了VP4、2A和3BCD区,O/BY/CHA/2010毒株和O/GZ/CHA/2010毒株与Mya98谱系的其他毒株的其他基因区的同源性较低。与非SEA拓扑型毒株(UKG/7B/2007、Akesu/58和PanAsia谱系毒株)相比,在2A、P2和3CD区,具有较高的同源性,表明O/BY/CHA/2010和O/GZ/CHA/2010可能具有这些毒株的生长特性。进一步的序列分析表明,O/GZ/CHA/2010毒株在L蛋白第10位增加了1个亮氨酸,在S片段缺失70个核苷酸。试验结果为进一步分析氨基酸插入和核苷酸缺失对毒株致病性的影响奠定了基础。
- 吕律杨帆何继军靳野郭建宏郑海学刘湘涛
- 关键词：口蹄疫病毒全基因组S片段
- H7N9亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶单因子血清的制备被引量：2
- 2014年
- 为获得特异性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)单因子血清,根据GenBank中A/Chicken/Zhejiang/SD007/2013毒株的序列人工合成了HA基因和NA基因,然后将其分别克隆至真核表达载体pCAGGS,构建了重组真核表达质粒pCAGGS-HA和pCAGGS-NA,经酶切和测序鉴定后将阳性重组质粒转染COS-7细胞,利用H7N9AIV鸡血清进行Western-blot分析。结果显示,重组质粒中的目的基因均能够成功表达。将重组质粒以每只200μg的剂量免疫4周龄SPF鸡,二免后第14天采集血清并用间接免疫荧光试验和Western-blot检测抗体。结果显示,免疫鸡产生的血清均能与对应质粒经COS-7细胞表达的蛋白发生特异性反应。结果表明,成功制备的H7N9AIV HA蛋白和NA蛋白单因子血清具有良好的反应原性,为提高H7N9AIV的血清学检测方法的准确性提供了一定技术支撑。
- 林中青王俊勇李小阳刘彬郭建宏朱启运
- 关键词：禽流感病毒真核表达
- 小反刍兽疫病毒China／Tib／07株V蛋白的原核表达及纯化被引量：2
- 2013年
- 为获得小反刍兽疫病毒(PPRV)V基因在大肠杆菌中的表达产物,根据GenBank中China/Tib/07株的V基因序列人工合成了V基因,然后将其克隆至表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-V,经酶切鉴定和测序确认后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达和GST亲和树脂柱纯化融合蛋白。SDS-PAGE检测结果显示,使用0.8mmol/L的IPTG在30℃、130r/min条件下诱导8h后,分子质量约为58ku的融合蛋白以可溶性状态大量表达;SDS-PAGE及Western-blot分析表明,用含有1mmol/L还原性谷胱甘肽的GST洗涤缓冲液洗涤8次并用2mmol/L的还原性谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱时可获得纯度较高的融合蛋白,且此融合蛋白可被抗GST标签的抗体所特异性识别。结果表明,成功表达并纯化了小反刍兽疫病毒的V蛋白,该项工作为研究其生物学功能积累了资料。
- 张学虎马旭升付钰广曾巧英才学鹏朱启运
- 关键词：小反刍兽疫病毒原核表达纯化
- 猪流行性腹泻病毒N基因的原核表达与鉴定被引量：1
- 2013年
- 为了克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因,根据GenBank中登录的PEDV(CV777株)的N基因序列设计1对特异引物,提取阳性临床样品的总RNA,通过RT-PCR方法获得PEDV的N基因。将N基因定向克隆至表达载体pET-28a-His-Sumo中,酶切和测序鉴定表明获得了阳性重组表达质粒pET-28a-His-Sumo-N。将阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,并进行IPTG诱导表达,用SDSPAGE和Western-blot对表达的目的蛋白进行分析。SDS-PAGE检测结果表明获得了60.0ku的表达产物,与目的蛋白大小符合;Western-blot结果显示,纯化后的目的蛋白能与PEDV阳性血清发生特异反应。表明成功对PEDV-N蛋白进行了原核表达,且纯化后的蛋白质具有良好的反应原性。
- 刘华南曹伟军杨帆张艳杨华王松豪郑海学
- 关键词：猪流行性腹泻病毒N基因原核表达纯化
- Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
- 2015年
- 为了获得Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以含Asia1型FMDV/JS/05毒株3B基因的pCAGGS-3B质粒为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a（＋）载体,进行原核表达及纯化。分别以Asia1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4~6周龄的雌性BALB/c小鼠,经过4次免疫后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5∶1~10∶1进行细胞融合,用本实验室建立的间接ELISA对融合后的细胞进行筛选,并进行4次有限稀释筛选出的阳性细胞扩大培养后,注射小鼠腹腔,制备腹水。对制备的腹水进行类别鉴定、反应原性和效价鉴定。结果表明,获得1株能稳定分泌抗Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白的细胞株,其抗体类别为IgM,腹水效价为1∶12 800,通过Western-blot和间接免疫荧光试验,确定其能识别口蹄疫病毒3B蛋白。
- 刘华南杨帆杨华吕律曹伟军石正旺岳城郑海学才学鹏
- 关键词：口蹄疫病毒单克隆抗体
- 口蹄疫病毒非结构蛋白对豚鼠CD8^+T细胞应答的免疫增强作用被引量：2
- 2012年
- 为了整体评价口蹄疫病毒非结构蛋白和前导蛋白对免疫应答的影响,选用反向遗传操作技术构建的与野生型毒株(Mya98/BY/2010)P1基因相同而非结构蛋白和前导蛋白不同的重组病毒(分别被命名为Re-Mya98/BY/2010)和Mya98/BY/2010)作为抗原,经BEI灭活后与4种佐剂乳化,制备不同的疫苗作为免疫原。然后免疫豚鼠,利用流式细胞仪检测免疫豚鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群的含量,ELISA方法检测免疫豚鼠血清中抗体应答。免疫后第28天进行攻毒试验。结果,抗原剂量相同的条件下,重组Re-Mya98/BY/2010疫苗比Mya98/BY/2010疫苗更能有效诱导CD8+亚群,每个时间点都含有较高的含量。ELISA结果显示,Mya98/BY/2010和Re-Mya98/BY/2010抗原都能诱导抗体应答,早期Re-Mya98/BY/2010诱导更高的抗体应答。豚鼠攻毒后,免疫Re-Mya98/BY/2010疫苗的保护率分别达到100%、83.33%、100%和50%,而免疫Mya98/BY/2010疫苗的保护率仅为20%、0、17%和25%,两者具有明显的统计学差异。结果表明,口蹄疫非结构蛋白在诱导免疫应答方面具有显著的诱导CD8+T淋巴细胞应答和提高免疫保护率的作用。
- 孙英军郑海学张艳靳野杨帆张志东刘湘涛
- 关键词：口蹄疫病毒非结构蛋白细胞免疫
