河南省科技攻关计划(112102110019)
- 作品数：15 被引量：51H指数：5
- 相关作者：程相朝张春杰郁川李银聚赵战勤更多>>
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- 减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究被引量：2
- 2017年
- 目的:为构建减毒鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系统,并将其开发为能够稳定携带外源基因的活疫苗载体。方法:利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的等位基因交换技术,以减毒鼠伤寒沙门菌株SL1344Δsse K1为亲本株,运用二步法筛选asd基因缺失株SL1344Δsse K1Δasd。将携带有asd基因的无抗性p YA3493质粒电转至上述缺失菌株SL1344Δsse K1Δasd,构建SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)重组菌株。结果:PCR及测序结果表明SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)构建成功。进一步研究表明重组菌株SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)血清型和强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相同,且能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相比均无明显差异。小鼠毒力试验表明,SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为5.24×108CFU,毒力较强毒株SL1344约下降至0.048%;免疫保护效力试验显示,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率,与亲本株SL1344Δsse K1基本一致。结论:以上结果表明,鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株宿主-载体平衡致死系统构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。
- 杨亚东丁轲张春杰程相朝贾艳艳何雷
- 关键词：鼠伤寒沙门菌
- 鼠伤寒沙门菌SL1344株sipB和crp基因缺失对其侵袭力影响的比较被引量：3
- 2015年
- 目的:为探讨sip B和crp基因对侵袭能力的影响。方法:以鼠伤寒沙门菌SL1344株sip B和crp缺失株为研究对象,进行生物学特性以及体内外侵袭力的研究。结果:生物学特性结果表明,sip B缺失株生化特性和亲本菌株相比没有发生明显的变化,而crp缺失株失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,并且生长速度较亲本菌株相比发生了显著的降低。体内侵袭力结果表明两个实验组小鼠肝脏和脾脏分离到的细菌数目均低于对照组,体外感染He La细胞结果显示sip B缺失菌株组的黏附率和侵入率较crp组和对照组均发生了显著的降低。结论:以上结果表明sip B基因在细菌侵染机体过程中扮演着重要的角色。
- 陈松彪张春杰程相朝李银聚李静何雷郁川张明亮余祖华贾艳艳赵战勤
- 关键词：鼠伤寒沙门菌侵袭力
- 5株鼠伤寒沙门菌基因缺失株的生物学特性比较被引量：5
- 2015年
- 为了探讨crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株成为鼠伤寒沙门菌减毒候选活疫苗的可能性,对缺失株的生物学特性进行研究。结果显示,缺失株的血清型仍和亲本菌株相同,其中crp、cya、crp/cya、crp/sipB与亲本菌株相比失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。通过口服方式把5株crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株接种KM小鼠进行毒力测定和免疫保护性测定,结果它们的半数致死量比野生株的至少高700倍,双基因缺失株的毒力更弱,攻毒后crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株的免疫保护率分别为90.0%,60.0%,50.0%,60.0%,60.0%。结果表明,crp基因缺失株可作为鼠伤寒沙门菌减毒活疫苗的候选株。
- 余祖华陈松彪张春杰程相朝李银聚何雷郁川李静李静
- 关键词：鼠伤寒沙门菌毒力生物学特性
- 以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定被引量：5
- 2013年
- 试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。
- 田芳华程相朝张春杰李银聚李静刘一尘
- 关键词：HN基因减毒鼠伤寒沙门氏菌
- 沙门氏菌减毒及其作为疫苗活载体的研究进展被引量：2
- 2012年
- 鉴于目前减毒沙门氏菌的研究日益引起人们的重视,从沙门氏菌减毒研究进展、减毒沙门氏菌疫苗活载体的构建、减毒沙门氏菌侵入及其携带外源基因诱导免疫应答的机制和减毒沙门氏菌疫苗活载体的应用等方面进行了系统地阐述,旨在为减毒沙门氏菌更深入的研究提供参考。
- 张明亮张春杰程相朝
- 关键词：沙门氏菌减毒疫苗
- 鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd平衡致死系统的构建及其生物学特性的研究被引量：9
- 2014年
- 目的:为了研制更加安全的鸡白痢沙门菌弱毒株,并将其开发为疫苗活载体。方法:本研究构建了鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd缺失株。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pREΔasd的大肠杆菌χ7213为供体菌,C79-13Δcrp为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/asd基因双缺失突变株。结果:PCR及测序结果表明C79-13ΔcrpΔasd构建成功。进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与亲本株C79-13相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢,毒力明显降低。结论:C79-13ΔcrpΔasd双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,并为研制安全有效的鸡白痢沙门菌疫苗弱毒株以及进一步将其开发为适于黏膜免疫的口服活载体疫苗奠定了基础。
- 陈松彪李静尚珂郁川张春杰程相朝李银聚赵战勤
- 猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1的构建及其生物学特性比较被引量：10
- 2014年
- 为开发更加安全有效且遗传背景清晰的减毒猪霍乱沙门菌活疫苗,运用自杀性质粒介导的等位交换技术缺失cya基因,分别构建猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1,并将两者的生物学特性与ΔcrpC78-1和疫苗株C500进行比较。以猪霍乱沙门菌C78-1为模板,分别扩增cya基因的上臂和下臂,然后通过中间转移载体pBluescriptⅡSK(+)克隆至自杀性质粒pRE112中,构建重组自杀性质粒pREΔcya,再与C78-1和ΔcrpC78-1分别进行接合转移,通过两步法筛选ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1。PCR及测序结果表明,ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1构建成功。生物学特性检测结果表明,所构建的ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1的血清型和生化特性与ΔcrpC78-1保持一致,并能够稳定遗传Δcya基因;两者的生长速度明显慢于疫苗株C500,且ΔcrpΔcyaC78-1的生长速度最慢。小鼠毒力试验表明,ΔcyaC78-1的毒力高于ΔcrpC78-1约1.7倍,较疫苗菌株C500下降至58.2%,但ΔcrpΔcyaC78-1的毒力较ΔcrpC78-1下降至0.194%,较C500下降至0.065%。构建的猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaC78-1遗传稳定,背景清晰,毒力降低,尤其是ΔcrpΔcyaC78-1双缺失株的毒力较疫苗株C500降低显著,为筛选更加高效的减毒猪霍乱沙门菌疫苗和进一步开发适用于猪的口服活疫苗载体奠定了良好基础。
- 张俊峰张春杰程相朝尚珂陈松彪张明亮郁川何雷赵战勤
- 关键词：猪霍乱沙门菌毒力生物学特性减毒活疫苗
- 猪霍乱沙门菌缺失株△cyaC78-1和△crp△cyaC78-1的构建及其生物学特性比较
- 为研究更加安全有效且遗传背景清晰的减毒猪霍乱沙门菌活疫苗候选株,本试验在野毒株C78-1和单缺失株△crpC78-1的基础上,运用白杀性质粒介导的等位交换技术敲除cya基因,分别构建了单缺失株△cyaC78-1和双缺失株...
- 张俊峰张春杰程相朝尚珂陈松彪张明亮郁川何雷
- 关键词：猪霍乱沙门菌毒力
- 文献传递
- 表达NDV HN蛋白重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13的构建及生物学特性被引量：1
- 2016年
- 利用平衡致死系统构建表达鸡新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)的减毒鸡白痢沙门菌活载体疫苗株。以p MD18-T-HN为模板,经PCR扩增出HN基因,定向插入原核表达载体p YA3493,构建重组质粒p YA-HN,再将其电转入减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13中,获得重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)。对重组菌的生化特性、生长特性、稳定性及安全性进行测定;并对重组菌表达的HN蛋白进行SDSPAGE和Western blot分析。结果显示,该重组菌保留了在DAP阴性环境中的生存能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及乳糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力;其生长速度明显低于强毒株C79-13,而与ΔcrpΔasd C79-13相比变化不明显;在体外连续传代能稳定遗传HN基因片段;经SDS-PAGE出现1条蛋白质量约为63 000的蛋白条带;Western blot证明重组菌表达的HN蛋白能与NDV阳性血清特异性结合;雏鸡口服接种试验表明ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)的毒力较强毒株C79-13下降183倍。上述结果表明,成功构建了能稳定表达NDV HN蛋白的口服重组减毒鸡白痢沙门菌,为开发鸡白痢—新城疫的基因工程口服疫苗奠定了初步基础。
- 尚珂程相朝郁川余祖华张俊峰毛福超韩璐韩于佩刘文慧陈桂华
- 关键词：NDVHN生物学特性
- 鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株的构建及生物学特性被引量：5
- 2015年
- 目的:为了研制更加安全的鼠伤寒沙门菌弱毒株,本研究构建了鼠伤寒沙门菌SL1344Δsip B基因缺失突变株。方法:首先构建含缺失585 bp sipB基因的重组自杀性质粒PREΔsipB,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344的sip B缺失株。结果:PCR及测序结果表明SL1344ΔsipB构建成功。进一步生物学特性研究表明,缺失株SL1344ΔsipB保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失585 bp的sipB基因,生长速度没有发生明显改变;但是,与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变,缺失株SL1344ΔsipB口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为1.70×108CFU,毒力较亲本株SL1344降低至1.4%,免疫保护效力实验显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。在给小鼠免疫后第14天血清抗体IgG达到最高。结论:结果表明,SL1344ΔsipB基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌sipB基因与其致病力之间的关系提供了方法,并为研制安全有效的沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。
- 陈松彪李静郁川何雷张春杰程相朝李银聚颜云飞金修哲陈桂华赵战勤
- 关键词：生物学特性
