湖北省科技攻关计划(2004AA202B01)
- 作品数：8 被引量：45H指数：4
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- 携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达被引量：3
- 2007年
- 将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。
- 姚清侠刘新文钱平郭东春陈焕春
- 关键词：猪Γ干扰素逆转录病毒PK-15细胞抗病毒活性水泡性口炎病毒
- 检测猪瘟抗体间接ELISA方法的建立及应用被引量：11
- 2007年
- 用猪肾传代细胞PK-15增殖猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒苗株(HCLV),病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、浓缩后作为包被抗原。经各种条件的优化,建立了检测猪瘟血清抗体的间接ELISA。所建立的间接ELISA抗原最佳包被浓度分22.28mg/L,血清最佳稀释度为1:40,与猪细小病毒、O型口蹄疫、猪衣原体阳性血清呈阴性反应,与HCV标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应;与标准阴性血清和临床未感染CSFV的猪血清呈阴性反应;用HI和本ELISA方法检测94个猪厂送检血清1455份。其中血清稀释液中不含PEG6000的914份送检血清阳性率为83.7%,与HI符合率为96.6%,HI阳性率略高为85.7%;血清稀释液中含2% PEG6000的541份送检血清阳性率为88.72%,与HI符合率为97.3%,HI阳性率为88.17%。结果表明本试验所建立的间接ELISA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点,可用于临床猪瘟血清抗体的定性和定量检测。
- 何雁南栾后利董晓辉曹毅姚清侠刘正飞陈焕春
- 关键词：猪瘟ELISA
- 猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定被引量：12
- 2008年
- 利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。
- 姚清侠钱平曹毅徐卓菲何雁南陈焕春
- 关键词：毕赤酵母分泌表达抗病毒活性
- 猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达
- 2006年
- 参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1-6中分别扩增出NS2长1389 bp和876 bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃,1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为40 ku处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带。Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,该表达产物主要存在于包涵体中。上述结果为NS2基因表达产物在免疫检测中的进一步应用奠定了基础。
- 郭东春钱平李祥敏徐卓菲姚清侠金梅林陈焕春
- 关键词：猪瘟病毒NS2基因
- 猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用被引量：12
- 2008年
- 为了获得高效分泌表达重组猪γ-干扰素(rPoIFNγ) ,将去除信号肽的编码梅山猪γ-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNγ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNγ。将线性化的pPIC9K-mPoIFNγ以化学方法(LiCl)转化入毕赤酵母菌株GS115(组氨酸缺陷型) ,转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,以G418(4 g/L)筛选到多拷贝菌株。SDS-PAGE和Western-blot检测结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17 000和23 000左右的mPoIFNγ特异蛋白,其表达量约为120 mg/L,占分泌型总蛋白的65 %;细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,结果表明rPolIFNγ具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为1.67×106U/mg。
- 姚清侠黄勤锋曹毅司有辉钱平陈焕春
- 关键词：猪Γ-干扰素毕赤酵母分泌表达抗病毒活性
- 猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性被引量：8
- 2007年
- 为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因（mPoIFNβ）插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法（LiCl）,与鲑鱼精DNA（ssDNA）共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明：表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%-30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸（pH2）,对热（56℃）部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法（CPE50）测定干扰素抗病毒活性,在MDBK（牛肾细胞系）中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×10^6U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。
- 姚清侠曹毅钱平徐卓菲何雁南司有辉陈焕春
- 关键词：毕赤酵母分泌表达抗病毒活性口蹄疫病毒
- 表达猪γ干扰素的重组腺病毒的构建和活性鉴定被引量：3
- 2007年
- 以刀豆素A(ConA)诱导的梅山猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆扩增出全长猪γ干扰素基因(PoIFNγ,501bp)。测序结果证实扩增得到的PoIFNγ与GenBank上所报道的猪γ干扰素基因同源性为100%。将PoIFNγ插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组。在293A包装细胞系中成功包装成完整的病毒粒子。将此重组后的腺病毒连续接种传至第10代,每代提取病毒基因组,PCR均能扩增出目的片段,以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性达1.3×106U/mL,证明该种表达猪γ-干扰素的重组腺病毒能稳定传代。
- 姚清侠徐卓菲何雁南司有辉钱平陈焕春
- 关键词：猪Γ-干扰素克隆腺病毒
- 猪瘟弱毒C81株全基因组测序及分子结构预测
- 2005年
- 参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列(GenBank:AY663656).C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白.序列分析表明,C81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84.4%～99.6%和91.6%～99.4%.同时,我们绘制了26株CSFV ORF的进化树,比较了CSFV 5'非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测.
- 徐卓菲钱平李祥敏郭东春姚清侠陈焕春
- 关键词：猪瘟病毒同源建模
- 猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达
- 参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1-6中分别扩增出NS2长1389bp和876bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至...
- 郭东春钱平李祥敏徐卓菲姚清侠金梅林陈焕春
- 关键词：猪瘟病毒NS2基因原核表达
- 文献传递
