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荧光定量PCR数据处理方法的探讨被引量：88: 2008年; realtime RT-PCR通过直接检测指数扩增期的PCR产物来确定基因的初始模板量,是定量基因表达最灵敏的方法,其准确性取决于扩增效率以及数据的处理方法。目前最常用的两种分析荧光定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量方法是通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较处理过的样品和未处理过的样品目的基因之间的表达差异。而相对定量又有双标准曲线法,2-△△Ct法以及动力学法。该文介绍了这些方法的推导、假设及其应用。; 唐永凯贾永义; 关键词：荧光定量PCR

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆、序列分析和结构预测被引量：1: 2008年; 采用RT—PCR和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法分离出奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶（P450aromA）的全序列，得到1784bp的全长cDNA，包括38bp5’非翻译区，1566bp阅读框以及含Poly（A）信号（AATAAA）的167bp3’非翻译区[不包括Poly（A）]。阅读框共编码521个氨基酸，计算的蛋白质分子量为59ku。同源性分析显示，奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其它鱼性腺P450arom具有70％以上的同源性，与其它鱼脑P450arom为60％左右同源，但芳香化酶高保守区包括Ⅰ-螺旋区，芳香化酶特异保守区Ⅱ和血红素结合区Ⅲ和其它鱼芳香化酶的同源性分别高达83％-96％，78％～86％和85—100％。系统发育分析表明奥利亚罗非鱼P450aromA与鱼类性腺P450arom属于同一分支的。生物信息学分析显示：奥利亚罗非鱼P450A基因编码的蛋白无信号肽，无跨膜区域，为非分泌蛋白，同时含有多个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，N-糖激化位点，N-肉豆蔻酰化位点，蛋白激酶C磷酸化位点。; 唐永凯李建林陈文华俞菊华; 关键词：奥利亚罗非鱼快速扩增CDNA末端

吉富罗非鱼IGF2基因分离及其单核苷酸多态性与体型、增重相关性被引量：15: 2010年; 胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor2,IGF2)是控制动物生长和脂肪沉积的重要基因之一。本文采用PCR方法分离了吉富罗非鱼(GIFT strain Nile tilapia Oreochromis niloticus)IGF2基因5475bp,包含由4个外显子组成的整个阅读框669bp以及3个内含子。通过比对吉富罗非鱼10个个体IGF2序列,共发现11处单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,本文检测了内含子1的621nt(C/T)和外显子3的161nt(A/G)两位点在192尾吉富罗非鱼中的基因型分布,并分析不同基因型与体型、增重的相关性。使用四引物扩增受阻体系PCR检测内含子1的621nt基因型,结果显示,CC、CT、TT基因型频率在雄鱼中分别为0.32、0.32、0.36,在雌鱼中分别为0.38、0.38、0.24;与体型、增重的相关性分析表明,此位点不同基因型只与雄鱼体型(体高/体长)显著相关(P<0.05),CC型个体显著高于CT和TT型个体。外显子3的A/G转换导致了MSPⅠ酶切位点改变,使用PCR-RFLP法检测该位点基因型,结果显示整个群体中不存在AA基因型,在雄鱼中,GG、AG基因型频率分别为0.71、0.29,而雌鱼中则为0.75和0.25;与体型、增重的相关性分析表明,此位点不同基因型只与雄鱼增重极显著相关(P<0.01),GG型的雄鱼明显较AG型增重快。; 陈雪峰杨国梁俞菊华唐永凯李建林李红霞; 关键词：吉富罗非鱼胰岛素样生长因子2 单核苷酸多态性体型增重

奥利亚罗非鱼EF-1α基因的克隆与结构分析被引量：2: 2008年; 真核生物延伸生长因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,是一种管家基因。本文通过RT-PCR克隆出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425bp,翻译成141个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.1ku。同源性分析显示,奥利亚罗非鱼EF-1α氨基酸序列与尼罗罗非鱼(O.niloticus)的相似性最高,为100%;与青(鱼将)(Oryzias latipes)、欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)、斑马鱼(Danio rerio)、鲑鱼(Salmo trutta)的相似性分别为92%、91%、85%、82%;与小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)、鸡(Gallus gallus)的相似性均为85%。同时克隆出奥利亚罗非鱼EF-1α相应的DNA序列,共506bp。cDNA与DNA的序列比对显示克隆出的奥利亚罗非鱼EF-1α含有1个内含子,这为将来设计EF-1α荧光定量引物以及测定其在不同组织中的表达量变化打下基础。; 唐永凯李建林李红霞陈雪峰俞菊华; 关键词：奥利亚罗非鱼克隆

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆及其表达被引量：14: 2008年; 采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端（RapidamplificationofcDNAends，RACE）法分离出奥利亚罗非鱼（Oreochromisaureus）卵巢芳香化酶（P450aromA）的全序列，得到1784bp的全长cDNA，包括38bp5’非翻译区，1566bp阅读框以及含Poly（A）信号（AATAAA）的167bp3’非翻译区[不包括Poly（A）]。阅读框共编码521个氨基酸，推算的蛋白质分子量为59kD。同源性分析显示，奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其他鱼类性腺芳香化酶（P450arom）具有70％以上的同源性，与其他鱼类脑P450arom有60％左右同源性，但其芳香化酶高保守区包括I．螺旋区、芳香化酶特异保守区和血红素结合区分别与其他鱼类P450arom的同源性高达83％--96％、78％～86％和85％-100％。系统发育分析表明，奥利亚罗非鱼P450aromA属于鱼类性腺P450arom，分子系统进化树分析结果与根据传统的形态学和生化特征分类结果基本一致。生物信息学分析显示，奥利亚罗非鱼P450aromA基因编码的蛋白无信号肽，无跨膜区域，为非分泌型蛋白。同时还含有多个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N．糖基激化位点、N．肉豆蔻酰化位点及蛋白激酶C磷酸化位点。使用Taqman探针法检测P450aromA在奥利亚罗非鱼成鱼各种组织中的表达。结果发现，P450aromA只在卵巢中表达。同时比较了鱼苗、鱼种和成鱼卵巢中P450aromA的表达差异，结果显示，鱼苗中无P450aromA的表达，成鱼中P450aromA的表达量是鱼种阶段的30倍。; 唐永凯李建林陈文华俞菊华; 关键词：奥利亚罗非鱼 RACE 芳香化酶 TAQMAN探针

奥利亚罗非鱼AMH基因结构及其表达被引量：8: 2009年; 抗缪勒氏管激素（antiMullerian hormone, AMH），也称缪勒氏管抑制物质（mullerian inhibiting substance, MIS），为肽类生长因子，属于TGFβ生长和分化因子家族。应用RTPCR和RACE法，从奥利亚罗非鱼精巢组织中分离出AMH的cDNA。分离到3′UTR长为621 bp和168 bp的两条cDNA，除了长度不一，两者之间只存在两个碱基的差别。5′UTR为 27 bp，阅读框为1 545 bp，翻译成514个氨基酸，其中，AMH-N域237个氨基酸，TGFβ域93个氨基酸。同源性分析显示，AMH保守性偏低，奥利亚罗非鱼与其它鱼类的相似性为32%~60%，与哺乳类动物只有19%~21%，而TGF-β域的保守性相对较高，与其它鱼类的相似性为54%~72%。基因结构分析显示，奥利亚罗非鱼AMH存在6个内含子，和斑马鱼AMH结构相似，和人、鼠AMH有较大差别，它们缺少奥利亚罗非鱼和斑马鱼AMH基因共有的内含子Ⅰ和Ⅵ。然而，启动子转录因子分析结果表明，奥利亚罗非鱼AMH启动子中也存在SRY, SF-1, GATA-4, Sox5, Sox9等结合位点。使用Taqman探针分析奥利亚罗非鱼AMH在成鱼不同组织中的表达以及鱼苗、鱼种、成鱼性腺中的表达量，结果显示AMH在成鱼的卵巢、精巢中均有表达，而在脑、肝、肌肉以及心脏中不表达。AMH在鱼苗性腺中不表达，在鱼种、成鱼中雄鱼AMH表达量显著高于雌鱼，而鱼种雄鱼AMH表达量是成鱼雄鱼的10倍。; 唐永凯李建林俞菊华; 关键词：奥利亚罗非鱼快速扩增CDNA末端 TAQMAN探针

奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼rDNA内转录间隔区序列特征被引量：5: 2009年; 核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)是经常被用作种和种群水平系统研究的分子序列。本文分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)内转录间隔区,包括部分18S序列,ITS1、5.8S、ITS2全序列及部分28S序列。4尾奥利亚罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其存在长度不同的a、b两种类型ITS1。a型长为536 bp,GC含量为69.96%;b型长为520 bp,GC含量为69.04%～69.42%。4尾尼罗罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其只存在a型ITS1,长为536～540 bp,GC含量为69.42%～70.19%。与b型ITS1相比,a型ITS1在16～31 nt有16 bp片段(GGCCCGCCTGCGGCGC)的插入。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼共20条ITS序列中,5.8S长度均为157 bp,GC含量为56.69%～57.96%;ITS2为408 bp,GC含量为72.79%～74.26%。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼ITS区序列相似性高达98.2%,表明这两种罗非鱼亲缘关系很近。此外,本文对14尾奥利亚罗非鱼、15尾尼罗罗非鱼以及15尾奥尼罗非鱼[O.aureus(♂)×O.niloticus(♀)]ITS1的扩增结果显示,奥利亚罗非鱼均有a、b两种类型ITS1;15尾尼罗罗非鱼中1尾为a、b两类型ITS1,14尾为a型ITS1;15尾奥尼罗非鱼中则有6尾具有a、b两类型ITS1,9尾为单一的a型ITS1。分析表明,奥利亚罗非鱼在ITS1这个位点一致性高,但尼罗罗非鱼中有1尾混杂了奥利亚罗非鱼的基因,同时也说明分子生物学手段应用于种质鉴定比形态学手段更为精确。; 陈雪峰李红霞俞菊华唐永凯李建林; 关键词：奥利亚罗非鱼尼罗罗非鱼内转录间隔区种质鉴定

黄颡鱼LRH-1基因的分离和表达被引量：3: 2009年; 肝受体类似物(Liver receptor homolog-1,LRH-1)是核受体家族Ftz-F1中一个亚家族成员,由于其在哺乳类卵巢中的高表达而被认为在卵巢类固醇合成的调控中起着一定的作用。本研究使用RT-PCR、RACE法分离到了黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)肝受体类似物基因(LRH-1)以及一个无活性的LRH-1′cDNA。LRH-1cDNA全长1945bp,包括5′非翻译区207bp,3′非翻译区238bp,开放阅读框1500bp,编码500个氨基酸,推算的蛋白分子量为57.19kD。LRH-1′全长1663bp,5′非翻译区283bp,3′非翻译区330bp,开放阅读框1050bp,编码350个氨基酸,推算的蛋白分子量为39.7kD。与LRH-1相比,LRH-1′缺少存在于基因5′端的锌指结构和3′端起转录激活作用的AF-2基序。不同动物LRH-1氨基酸序列比对结果表明,黄颡鱼LRH-1和其他动物的LRH-1相似性为79%-85%,和其他动物的类固醇生成因子(SF-1)相似性为59%-66%。系统发育树显示,Ftz-F1分为两大支,一支包括鱼类SF-1;另一支又有2个分支,分别包含其他动物的SF-1和所有动物的LRH-1,在LRH-1分支中鱼类LRH-1单独为一小支。以β-actin为内标的荧光实时定量RT-PCR结果显示,LRH-1在雌、雄黄颡鱼脑、肝、肾、性腺均有表达,以肝脏的表达量为最高,雌鱼各组织的表达量均比雄鱼高,其中肝脏和性腺差异明显(P<0.05);在卵巢的不同发育阶段,该基因的表达量也不尽相同,Ⅲ期卵巢表达量最高,明显高于Ⅴ期(P<0.05),Ⅴ期又明显高于Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ期(P<0.05);注射催产素促黄体释放激素类似物(LRH-A)12h后,LRH-1在脑的表达量没明显变化,在肝脏和肾脏的表达量明显增加,而在卵巢的表达量明显下降。; 唐永凯俞菊华徐跑李建林; 关键词：黄颡鱼系统发育实时定量RT-PCR

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江苏省自然科学基金(BK2006029)

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