国家自然科学基金(31360287)
- 作品数：6 被引量：7H指数：2
- 相关作者：邓彦飞石德顺杨素芳邓海莹罗婵更多>>
- 相关机构：广西大学广西壮族自治区人口和计划生育研究中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家教育部博士点基金更多>>
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- 水牛转录因子Sox2和Lin28克隆与表达研究被引量：1
- 2015年
- 本研究克隆水牛特异性转录因子Sox2和Lin28,构建表达载体,为进一步研究2个基因在水牛干细胞多能性调控中的作用奠定基础。以胎牛生殖嵴总RNA为模版,采用RT-PCR扩增Sox2和Lin28的编码区序列(CDS),构建逆转录表达载体pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28,转入NIH3T3细胞,鉴定其表达情况。结果表明:水牛Sox2和Lin28的CDS全长分别为966 bp和618 bp,蛋白结构保守;Sox2、Lin28氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为96%、95%、94%、94%和98%、97%、89%和91%;pMSCV介导的Sox2和Lin28能在NIH3T3细胞中表达。
- 邹灵秀邓彦飞陈凤乔树叶杨素芳石德顺
- 关键词：水牛转录因子克隆真核表达
- 电穿孔法转染水牛脂肪干细胞与成纤维细胞的研究被引量：3
- 2016年
- 本研究以不同培养代数(P)水牛脂肪干细胞(buffalo adipose-derived stem cells,BASC)和成纤维细胞(buffalo fetal fibroblasts,BFFs)为研究对象,采用电穿孔法对其进行转染,比较转染后细胞的相对存活率和转染效率,为生产高效转基因供体细胞奠定基础。以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,电转染48 h后观察荧光表达,收集细胞采用血细胞计数法和流式细胞仪分析细胞相对存活率和转染效率。结果表明:电转后的BASC和BFF表达EGFP,BASC相对存活率低于BFF,P10之前BFF存活率更稳定;BASC和BFF转染效率随培养代数增加出现不同程度的降低,P10之前BFF转染效率更稳定。电转技术可用于转染BASC和BFF,并获得较高的转染效率;使用体外培养早期代数的BASC(P8之前)和BFF(P10之前)可以获得更稳定转染效率的转基因细胞。
- 陈凤石德顺黄贵婷陈自洪杨素芳邓彦飞
- 关键词：水牛电穿孔法转染效率
- 水牛bFGF基因的克隆、逆转录病毒载体的构建和鉴定
- 2017年
- 对水牛碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因进行克隆、序列分析,构建bFGF表达载体,为其在水牛干细胞中的功能研究奠定基础。以水牛胎儿组织为材料提取总RNA,利用逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)克隆得到的bFGF基因编码区序列,进行生物信息学分析,构建表达bFGF的逆转录病毒载体(pMXs-bFGF-IRESGFP),并在293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibroblast,BFF)上进行重组载体表达鉴定。结果表明,水牛bFGF基因编码区全长468bp,编码155个氨基酸,含有纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族特有的蛋白结构;逆转录病毒载体介导的bFGF基因能在293T细胞和BFF中表达。本研究克隆出水牛bFGF编码序列,构建的逆转录病毒载体能在不同真核细胞中表达bFGF。
- 农恬颖杨小玲崔佳瑜杨素芳朱鹏石德顺邓彦飞
- 关键词：水牛碱性成纤维细胞生长因子真核表达
- 水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达
- 2014年
- 【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系(iPSC)奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列(Oct4:NM_174580,Nanog:NM_001025344)设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列(the coding sequences,CDS)和DNA全长序列,其中Oct4全长DNA分3段扩增,Nanog全长DNA分2段扩增;利用生物在线分析软件对水牛Oct4和Nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对;采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切,T4连接酶,将Oct4和Nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上,构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibroblasts,BFFs),逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs,感染12—15h后,继续培养48 h;通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp,编码361个氨基酸,DNA全长4 509 bp,包括5个外显子和4个内含子;Nanog CDS全长903 bp,编码301个氨基酸,DNA全长4 473 bp,包括4个外显子和3个内含子;将Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank,分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004;Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%,Nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%;Oct4和Nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似,分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域;成功构建表达Oct4和Nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;逆转录病毒系统pMX�
- 邓彦飞刘庆友邓海莹罗婵杨素芳石德顺
- 关键词：水牛NANOG基因克隆异位表达
- 水牛转录因子 c-Myc 克隆和表达研究被引量：3
- 2014年
- 原癌基因c-Myc是诱导多能干细胞(iPSC)生产中重要的转录因子之一。水牛c-Myc的克隆和表达,可以为下一步研究其功能和使用特异性转录因子生产水牛iPSC奠定基础。采用RT-PCR扩增水牛c-Myc编码区(CDS),RT-PCR和免疫荧光技术检测内源c-Myc在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)和胃上皮细胞(BSEC)中的表达情况;构建表达c-Myc的逆转录病毒载体(pMX-c-Myc),病毒法转入BFF中,免疫荧光技术分析外源c-Myc在BFF中的表达情况。结果表明:c-Myc在水牛BFF和BSEC中都有表达;水牛c-Myc的CDS全长1 320 bp,氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应蛋白的同源性分别为98%、96%、91%和86%,与小鼠c-Myc蛋白的结构相似;逆转录病毒载体介导的c-Myc能在BFF中表达。
- 邓彦飞石德顺刘庆友邓海莹罗婵杨素芳
- 关键词：IPS细胞真核表达水牛
- 水牛转录因子Klf4基因编码区序列克隆及在真核细胞中表达研究
- 2013年
- Krüppel样因子4(Klf4)在调控细胞增殖、分化和胚胎发育中有重要作用,也是生产诱导多能干细胞(iPSC)重要的转录因子之一。本研究对水牛Klf4进行克隆和表达研究,为生产水牛iPSC和研究其在体细胞重编程中的机理奠定基础。采用RT-PCR克隆并分析水牛Klf4编码区序列(CDS);mRNA水平和蛋白水平检测Klf4在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)和胃上皮细胞(BSEC)中的表达情况;构建表达水牛Klf4的逆转录病毒载体(pMX-Klf4)、病毒感染BFF、免疫荧光技术分析外源Klf4在BFF中的表达情况。结果表明:水牛CDS全长1 434 bp,氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为99%、97%、92%和92%,蛋白结构保守;内源Klf4在BFF和BSEC中都有表达,pMX介导的外源Klf4能在BFF中表达。
- 邓彦飞石德顺刘庆友邓海莹罗婵杨素芳
- 关键词：水牛KLF4真核表达
