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骨髓间质干细胞下调免疫反应的实验研究被引量：6: 2006年; 目的:研究骨髓间质干细胞(M esenchym al stem cells,MSCs)下调免疫反应的作用及其机制。方法:采用流式细胞分析(FCM)鉴定MSCs的纯度,用3H-TdR掺入法测定MSCs对ConA刺激的淋巴细胞增殖的影响,利用RT-PCR和Real-tim e PCR检测TGF-β1、IL-8、IL-10的基因表达,同时进行皮肤移植模型研究。结果:MSCs对ConA刺激的淋巴细胞增殖的影响与MSCs和淋巴细胞的比值有关。RT-PCR结果显示MSCs对淋巴细胞分泌TGF-β1无显著性影响,而Real-tim e PCR的结果显示MSCs促进淋巴细胞分泌IL-10,减少淋巴细胞分泌IL-8。皮肤移植实验显示MSCs能延长异种移植皮肤的存活时间。结论:MSCs能下调免疫反应和抑制皮肤移植排斥反应,其可能的机制是通过促进淋巴细胞分泌IL-10以及减少淋巴细胞分泌IL-8来发挥作用。; 毛飞许文荣许化溪朱伟韩崇旭胡嘉波孙晓春钱晖; 关键词：骨髓间质干细胞免疫调节淋巴细胞

BMI-1干扰基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定: 2008年; 背景:BMI-1的表达对于维持干细胞特别是造血干细胞、神经干细胞、肿瘤干细胞的自我更新能力是不可缺少的。目的:以细菌内同源重组法构建携带BMI-1干扰基因的重组腺病毒载体,制备重组腺病毒pShuttle-H1-AdEasy-1-P1P2/P3P4。设计、时间及地点:开放性实验,于2006-02/2007-08在江苏大学医学技术研究所完成。材料:限制性内切酶由NewEngland BioLabs提供,腺病毒骨架质粒pAdEasy-1、大肠杆菌BJ5183、Ad293细胞由南京师范大学生科院分子医学生物技术江苏省重点实验室惠赠。方法:采用细菌内同源重组法构建RNA干扰腺病毒载体pShuttle-H1,PmeⅠ线性化质粒,通过同源重组腺病毒骨架蛋白pAdeasy-1,得到重组的腺病毒干扰质粒;经PacⅠ线性化后用脂质体转染方法转染293A细胞,收获腺病毒重组病毒子,以未转入小干扰RNA片段的重组质粒为对照,包装后收集细胞,反复裂解细胞获得腺病毒。主要观察指标:腺病毒质粒重组构建及鉴定情况。结果:经酶切鉴定,已成功构建siRNA的重组腺病毒表达载体pShuttle-H1-AdEasy-1-P1P2/P3P4,获得了重组病毒子。结论:利用新型腺病毒载体pAdeasy-1系统可在短期内制备BMI-1干扰基因的腺病毒表达载体,并制备出重组腺病毒P1P2/P3P4。; 朱伟许文荣乔纯钱晖; 关键词：SIRNA BMI-1 腺病毒载体

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞被引量：4: 2008年; 目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞。方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibrob lastgrowth factor,bFGF)及CC l4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志。结果:在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alphafetal prote in,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18,CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-d ioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuc lear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性。与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO。结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CC l4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源。; 司煜安许文荣严永敏钱晖朱伟周忠海徐静周洪兴曹慧玲李继刚; 关键词：骨髓间充质干细胞肝细胞细胞分化

人骨髓间质干细胞ING4基因的克隆及其慢病毒表达载体构建: 2007年; 目的:克隆人骨髓间质干细胞ING4(inhibitor of growth famility,member4)基因,构建其慢病毒表达载体PNL-ING4。方法:提取人骨髓间质干细胞(hMSCs)总RNA,经RT-PCR扩增出ING4cDNA,克隆至PMD19-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和测序,构建慢病毒表达载体PNL-ING4,用双酶切、基因测序进行鉴定。结果:RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确。结论:成功从hMSCs克隆了ING4基因并成功构建其慢病毒表达载体PNL-ING4,为进一步研究ING4基因的作用与抗肿瘤机制奠定了基础。; 张蕾蕾许文荣乔纯钱晖朱伟李继刚周洪兴司煜安周宗海阴晴; 关键词：ING4 慢病毒表达载体人骨髓间质干细胞克隆

TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达被引量：1: 2008年; 目的:构建携带绿色荧光蛋白的TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒表达载体,转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)。方法:设计含有GM-CSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物,PCR扩增TNFα-Tumstatin,将扩增产物亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组。筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒,酶切鉴定并测序。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,经过包装、扩增后感染hUCMSCs并检测细胞内融合基因的表达。结果:重组腺病毒质粒经PCR和PacⅠ酶切鉴定,证实含有TNFα-Tumstatin融合基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒感染的hUCMSCs表达绿色荧光蛋白和融合基因。结论:成功构建了TNFα-Tumstatin融合基因的腺病毒表达载体,能高效率感染hUCMSCs,为进一步研究融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤效应奠定了基础。; 周忠海许文荣朱伟乔纯王兴忠陈圆司煜安徐静周洪兴张蕾蕾李继刚钱晖; 关键词：腺病毒载体融合基因细胞转染

慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究被引量：3: 2008年; 目的:分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法:采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果:分离培养出人骨髓来源的MSCs,并用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论:获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。; 张徐钱晖朱伟曹慧玲徐学静司煜安王梅许文荣; 关键词：间质干细胞慢病毒转染

PKH26标记大鼠骨髓间质干细胞的实验研究被引量：3: 2006年; 目的建立PKH26标记大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的方法,并探讨标记MSCs的基本生物学活性。方法大鼠MSCs按PKH26标记程序进行标记后培养,采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析仪等观察细胞生长状态和荧光标记活性变化;应用RT-PCR检测标记后MSCs的GAPDH、nucleostemin及Bmi-1基因的表达;选用碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及骨形成蛋白3(BMP3)基因表达分析等技术,观察标记后MSCs体外分化成骨细胞的特性。结果PKH26标记后细胞呈红色荧光,荧光的强度随着PKH26浓度的增加而递增,并与传代时间和代数相关;标记后细胞生长状态良好,基本生长特性如传代培养和生长曲线无明显改变;细胞GAPDH、nucleostemin及Bmi-1基因表达未见改变;标记MSCs诱导后ALP、Von Kossa染色阳性,呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征,并表达BMP3基因。结论PKH26可稳定标记大鼠骨髓MSCs并能传代培养,标记后细胞形态、生长活力及多向分化潜能等无明显影响,该技术可用于追踪MSCs转归、可塑性及干细胞移植方面的实验研究。; 杨欢许文荣朱伟王兴忠乔纯胡嘉波钱晖陈永昌; 关键词：骨髓间质干细胞 PKH26 成骨细胞 RT-PCR

FP248基因表达检测在白血病和肿瘤诊断中的意义: 2008年; 目的用real-time PCR和RT-PCR检测FP248 mRNA表达,研究其在白血病和肿瘤诊断中的意义。方法用real-time PCR和RT-PCR检测肿瘤细胞株(SGC-7901、A549、95D、SW480、U937、PC3)和白血病(ALL、CML、AML)患者骨髓或外周血以及胃癌等消化道肿瘤患者癌组织中FP248 mRNA的表达水平;用RT-PCR技术检测消化道肿瘤患者外周血单个核细胞(PB-MC)FP248 mRNA的表达。结果SGC-7901细胞株FP248 mRNA强阳性,A549和95D细胞弱阳性,其他细胞株阴性;ALL、CML、AML患者骨髓及PBMC FP248表达上调;胃癌、直肠癌、结肠癌患者癌组织中FP248 mRNA的表达高于癌旁组织,食道癌组织为阴性;胃癌、结肠癌和直肠癌患者PBMC未检测到FP248 mRNA。结论FP 248的表达可能在白血病和消化道肿瘤的发生发展中起重要作用;检测该基因的表达可能有助于白血病和消化道肿瘤的诊断。; 李继刚许文荣钱晖朱伟王胜步雪峰张蕾蕾徐静司煜安陈忠周忠海周洪兴施晓凤; 关键词：FP 白血病消化道肿瘤 REAL-TIME

慢病毒转染大鼠骨髓间质干细胞条件优化及其性质研究: 目的建立慢病毒载体稳定转染大鼠骨髓间质干细胞的方法并研究转染后细胞性质.方法采用基于HIV-1的VSV-G假膜化的慢病毒载体转染大鼠骨髓来源的间质干细胞；研究不同转染条件包括感染复数、感染方式、感染次数对转染效率的影...; 张徐朱伟王梅曹慧玲徐学静钱晖许文荣; 关键词：间质干细胞基因治疗慢病毒转染

人骨髓间质干细胞PKH26荧光标记技术被引量：12: 2006年; 目的建立一种 PKH26体外荧光标记人骨髓间质干细胞(MSCs)的方法。方法培养人骨髓间质干细胞,按 PKH26标记程序进行标记后培养,采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析,观察标记后人 MSCs 生长状态、荧光强度变化和传代培养效果。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等方法观察标记细胞的生物学功能。结果标记后 MSCs 呈红色荧光,标记率达100%,体外连续传代培养7代后,荧光标记细胞荧光强度逐渐减弱,荧光标记细胞百分比逐渐减低。PKH26标记MSCs 的生长形态、生长活力、nucleostemin、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因表达及体外诱导分化能力等生物学特性不发生改变。结论 PKH26荧光标记人 MSCs 是一种有效、实用的方法,该方法对MSCs 转归、可塑性及 MSCs 移植治疗研究具有重要的价值。; 王兴忠许文荣朱伟杨欢乔纯钱晖胡嘉波; 关键词：间质干细胞骨髓

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卫生部科学研究基金(WKJ2005-2-024)

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