国家自然科学基金(31360212)
- 作品数：6 被引量：14H指数：3
- 相关作者：张青峰高书颖申慧芳邵敏张芳婷更多>>
- 相关机构：遵义医学院北京大学深圳医院澳门科技大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金贵州省科学技术基金贵州省科技厅科学技术基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区及其gRNA靶位点鉴定被引量：2
- 2020年
- 目的ezrin基因在胰腺癌中过表达,其上游序列对于基因表达具有重要作用。文章拟敲除胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区,鉴定其基因编辑gRNA靶位点。方法将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰腺癌细胞Panc-1,采用双荧光素酶报告基因检测系统,鉴定ezrin转录调控区。使用在线软件预测ezrin转录调控区上下游gRNA靶位点,构建基因编辑重组质粒pX459-sgRNA-L和pX458-sgRNA-R。将重组质粒共转染Panc-1细胞,针对gRNA靶位点进行基因组DNA的PCR扩增和亚克隆测序分析,鉴定ezrin转录调控区的靶向敲除。向转染重组质粒的Panc-1细胞中加入嘌呤霉素初步筛选,采用水溶性四氮唑盐法检测细胞增殖能力。结果荧光素酶报告基因检测结果显示,Panc-1细胞中ezrin基因-1297/-1186片段对SV40启动子和ezrin启动子具有转录增强作用。亚克隆测序结果显示,携带ezrin转录调控区gRNA靶位点序列的重组质粒共转染至Panc-1细胞,细胞基因组DNA出现片段缺失,位于gRNA-L和gRNA-R靶位点之间。细胞增殖实验结果显示,转染重组质粒的Panc-1细胞,其增殖能力显著受到抑制。胰腺癌Panc-1细胞ezrin基因-1297/-1186为转录调控区,其上游gRNA-L和下游gRNA-R序列可作为基因编辑靶点。结论实现了ezrin转录调控区的靶向敲除,Panc-1细胞增殖能力的抑制有可能与ezrin转录调控区的敲除有关。
- 代基强野庆松白圣凯张青峰高书颖
- 关键词：EZRIN基因胰腺癌
- ezrin增强子敲除对人食管癌细胞的影响
- 目的:探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除人食管癌细胞ezrin增强子对食管癌Eca-109细胞基因表达、MAPK通路相关蛋白表达、细胞增殖及迁移的影响。方法:前期构建了一系列分别靶向ezrin增强子的CR...
- 雷悦
- 关键词：基因敲除食管癌ECA-109细胞
- 文献传递
- 几种肿瘤细胞中ezrin基因增强子区转录调控特性的研究被引量：3
- 2014年
- 该文采用Western blot技术检测人食管癌EC109细胞、鼻咽癌CNE2细胞和宫颈癌HeLa细胞中Ezrin蛋白的表达;采用DNA片段定向克隆技术构建一系列携带ezrin基因增强子区–1541/–706序列的报告基因表达载体,将载体瞬时转染EC109、CNE2和HeLa细胞,检测荧光素酶活性;研究肿瘤细胞中ezrin基因增强子区的转录调控特性。实验结果显示,在被检测的三种肿瘤细胞中,Ezrin蛋白的表达水平没有明显不同。EC109细胞中,当ezrin基因–1541/–706片段正向位于无启动子的报告基因上游时,表现出类似启动子的转录激活作用;当这一片段反向连接时转录激活作用几乎消失。当–1541/–706片段正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著增强荧光素酶表达;然而,当这一片段反向位于启动子上游以及正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。ezrin基因–1541/–706片段在CNE2和HeLa细胞中的转录调控作用,与其在EC109细胞中的转录调控作用部分相似,但不完全相同。结果表明,ezrin基因增强子区具有转录激活和转录增强双重作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性以及细胞特异性。
- 张青峰卫金岐张芳婷邵敏申慧芳高书颖
- 关键词：EZRIN基因增强子转录调控肿瘤细胞
- 靶向ezrin增强子关键区的CRISPR/Cas9载体的构建被引量：5
- 2017年
- 构建靶向人ezrin增强子关键区的CRISPR/Cas9载体并检测其基因敲除功能。设计2个gRNA,分别靶向人ezrin增强子关键区的上、下游。合成gRNA寡核苷酸序列,连接至质粒p X459构建重组质粒p X459-sgRNA-EL和p X459-sgRNA-ER。将鉴定正确的CRISPR/Cas9重组质粒共转染至食管癌EC109细胞中,提取细胞基因组DNA,针对gRNA靶位点两侧进行PCR扩增和亚克隆测序分析。经限制性内切酶酶切和测序鉴定表明,CRISPR/Cas9重组质粒构建正确。在共转染重组质粒的细胞基因组DNA中检测到ezrin增强子关键区的缺失。成功构建了靶向人ezrin增强子关键区的CRISPR/Cas9载体,能够实现目标序列的定向敲除。
- 郭晓龙张青峰野庆松莫镇涛李文娜高书颖
- H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及免疫原性被引量：2
- 2014年
- 用昆虫杆状病毒表达系统表达了高致病性禽流感H5N1 HA蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,HA蛋白表达分子量约为70 ku;将HA蛋白制成油乳液,免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,收集血清,以血凝抑制试验(HI)和血清IgG抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)评估体液免疫,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)评估细胞免疫。试验结果表明:重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组免疫小鼠后,血清中和抗体效价及ELISA IgG效价均显著高于PBS组,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。ELISPOT试验数据显示,重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组小鼠脾单个核细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞数量显著高于PBS组,而重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。用昆虫杆状病毒表达系统表达H5N1 HA蛋白制成油乳液能诱导体液免疫和细胞免疫,能为预防高致病性禽流感H5N1候选疫苗的筛选提供依据。
- 申慧芳申惠敏贾秀珍张青峰
- 关键词：HA蛋白免疫反应
- 蓝树莓叶总黄酮对大鼠非酒精脂肪肝形成的防治作用被引量：3
- 2014年
- 目的研究不同浓度的蓝树莓叶总黄酮对大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)形成的防治作用。方法将60只雌、雄各半的SD大鼠分成5组:正常组(N)喂以普通饲料;高脂饮食模型组(M)喂以改良的高胆固醇饲料,诱发形成脂肪肝模型;蓝树莓叶总黄酮低、中、高浓度实验组(HLF1、HLF2、HLF3)在喂高脂饲料的同时分别灌胃20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、80 mg·kg-1体重蓝树莓叶总黄酮溶液各3 m L。实验180 d后取动物血清、肝脏,检测动物血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)的含量,制备大鼠肝脏组织石蜡切片观察其病理学变化。结果蓝树莓叶总黄酮实验组各组与模型组相比,其血清的TC、TG、LDL-C、AST、ALT等含量均显著下降(P<0.01),而HDL-C含量则明显上升(P<0.01),且与蓝树莓叶总黄酮的浓度呈明显的量效关系。石蜡切片也显示蓝树莓叶总黄酮实验组动物肝脏中的脂质积累和脂肪肝病理学变化明显轻于模型组。结论蓝树莓叶总黄酮可以降低大鼠脂肪变性程度,对高脂饮食引起的脂肪肝具有明显的防治作用。
- 张青峰赵远锋邵敏王燕姬可平张伟高书颖
- 关键词：总黄酮非酒精性脂肪肝
- 携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定
- 2014年
- 目的构建携带人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响。结果经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒。重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞。结论成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量。
- 张青峰张芳婷申慧芳高书颖
- 关键词：人端粒酶逆转录酶基因重组慢病毒共转染
